兔外周血间充质干细胞分离培养及脱细胞软骨基质制备实验的研究

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1、山东大学硕士学位论文兔外周血间充质千细胞的分离培养及脱细胞软骨基质制备的实验研究硕士研究生孙良专业外科学(整形)导师栾保华教授摘要目的l探讨在皮肤损伤条件下，外周血来源间充质干细胞(peripheralbloodmesenchymalstemcells，PBMSCs)的分离培养，并观察其成骨及成软骨细胞分化的潜能。从而建立一种兔外周血间充质干细胞的分离培养方法，为将外周血来源的MSCs作为组织工程种子细胞奠定实验基础。2使用化学消化法脱除同种异体肋软骨组织内细胞成分，形成脱细胞基质。同时采用自体外周血MSCs体外诱导向软骨细胞分化作为

2、种子细胞，与同种异体软骨脱细胞基质共同培养，观察诱导的MSCs在脱细胞基质上的生长情况，以期寻找到组织工程化软骨构建所需的理想种子细胞和生物支架材料。方法1．应用新西兰大白兔建立皮肤创伤模型，抽取创伤前后兔股静脉血，用密度梯度离心法分离纯化单个核细胞。2．分别应用Q-MEM培养基和LG-DMEM培养基培养细胞，观察外周血MSCs(mesenchymalstemcells，MSCs)的生长情况，并用MTT法测定细胞生长曲线，比较不同培养基对外周血MSCs培养效果的影响。。3．诱导MSCs向成骨细胞分化：取P2代细胞，实验组用成骨诱导剂诱

3、导MSCs定向分化，对照组用含10％胎牛血清的Q-MEM常规培养液自然分化，观察细胞形态，并分别进行碱性磷酸酶染色和茜素红染色，以检测碱性磷酸酶及钙化结节的形成。4．诱导MSCs向软骨细胞分化：取P2代细胞，实验组用软骨诱导剂诱导MSCs定向分化，对照组用1096胎牛血清的Q—MEM常规培养液自然分化，观察细胞山东大学硕士学位论文形态，免疫组织化学染色法检测II型胶原的表达。5．另取新西兰大白兔处死后立即切取肋软骨，以无菌PBS冲洗后，顺序浸入1％TritonX-100和ONAse、RNAse溶液内振荡消化。其中以1％Trixton消

4、化时间长短分为24小时组、48小时组、72小时组和96小时组。分别采用组织切片HE染色、扫描电镜等方法观察样本脱细胞效果并比较。结果一1．经创伤刺激后所获得的兔外周血MSCs数量明显增加(尸

5、具有统计学意义(P

6、向多角形、圆形转化，随着诱导时间延长，出现聚集生长的趋势；对照组细胞基本保持长梭形，增殖能力旺盛。免疫组化结果显示，实验组II胶原表达逐渐增强，培养两周后实验组可见胞浆内黄色或棕黄色颗粒出现，而对照组阳性细胞不明显。5．使用1％TritonX-100溶液与酶联合消化法制备兔同种异体肋软骨脱细胞基质至少需要作用96小时，方可完全脱除软骨部分全部细胞成分。HE染色显示96小时组肋软骨样本细胞成分完全脱失：扫描电镜显示脱细胞基质软骨细胞脱除彻底，可见软骨基质表面软骨陷窝结构清晰，陷窝内无细胞结构。结论1．经皮肤损伤刺激后可以从兔外周血中获取

7、MSCs。2山东大学硕上学位论文2．a—MEM较LG-DMEM更适合外周血MSCs的生长。3．体外分离培养的外周血间充质干细胞具备向成骨及软骨细胞分化特性。4．去污剂一核酸酶联合消化法可有效去除肋软骨细胞成分，对细胞外基质无明显破坏，可保持脱细胞基质结构完整性。关键词：外周血；间充质干细胞；分离培养；分化；成骨细胞；软骨细胞；细胞外基质3山东大学硕士学位论文ISOLATION，CULTUREANDDIFFERENTIATIONOFRABBlTPERIPHERALBLooDMESENCHYMALSTEMCELLSINⅥTRoANDPRE

8、PARATIONOFECMPostgraduatestudent：Sunliang而forProfessor：LuanBaohuaABSTRACTObjeetiveToexplorehowtoisolateandcult