体外微团培养兔骨髓间充质干细胞形成软骨细胞

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1、体外微团培养兔骨髓间充质干细胞形成软骨细胞：李斌　张伟　王健　孙水　吴帅【摘要】［目的］探讨兔骨髓间充质干细胞（bonemesenchymalstemcells，BMSCs）体外诱导形成软骨细胞的方法，以及转化生长因子-β1（transforminggroethylthiazolyltetrazolium，MTT）比色试验、糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）检测和免疫组织化学染色。［结果］A、B、C三组Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性；MTT吸光度值和GAG含量检测结果均为：A组>C组>D组，B组&g

2、t;C组>D组，统计学有显著差异。［结论］兔BMSCs在一定条件下可以诱导成软骨细胞，TGF-β1和IGF-Ⅰ、bFGF在BMSCs向软骨细胞分化和增殖时起协同作用。【关键词】骨髓间充质干细胞　软骨细胞　转化生长因子-β1　胰岛素样生长因子-Ⅰ　碱性成纤维细胞生长因子　　Abstract:［Objective］Tostudythemethodsofinducingbonemesenchymalstemcells（BMSCs）ofrabbitsintochondrocytesinvitroandtheinteractiono

3、ftransforminggroarilyculturedandsubculturedinvitro,andthendividedintofourgroupsaccordingtothedifferenceoffactors:groupAreceivingTGF-β1andbFGF;groupBreceivingTGF-β1andIGF-Ⅰ;groupCreceivingTGF-β1;groupDreceivingnocellgroethylthiazolyltetrazolium（MTT）assay,measurementof

4、glycosaminoglycan(GAG)andimmunohistochemistry.［Results］ImmunohistochemicaldetectionofcollagenⅡBMSCsintochondrocytes.　Keyesenchymalstemcells;chondrocytes;transforminggroesenchymalstemcells，BMSCs）取材简单，体外增殖能力强，并且具有多向分化潜能，成为了软骨组织工程理想的种子细胞。本研究旨在探讨骨髓间充质干细胞体外向软骨细胞分化的条件以及转化生

5、长因子-β1（transforminggrol的Percoll分离原液购自Sigma公司；Dulbecco’sModifiedEagleMedia(DMEM)购自Hyclone公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；胰蛋白酶购自华美生物制品公司；Ⅱ型胶原免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。　　1.1.3实验器材　　培养板和培养瓶：Hyclone公司；CO2恒温培养箱：美国Nuaire公司；倒置显微镜：日本Olympus公司；超净工作台：苏州净化设备公司；离心机：北京医用离心机厂；分光光度计：Duseries600，USA；酶

6、联标记检测仪：MultiskanMS，芬兰。　　1.2实验方法　　1.2.1兔BMSCs的体外分离和培养　　取2～3个月龄健康新西兰大白兔麻醉毕，无菌条件下穿刺髂骨成功后接上10ml空针，内含3000U/ml的肝素0.4ml，抽取骨髓6～8ml。将肝素骨髓与等体积的D-hanks液混合，洗涤去除脂肪。经1.073g/ml的Percoll分离液密度梯度离心后（2500r/min,20min）,吸取单个核细胞层，D-hanks洗涤后收集细胞，接种到含有完全培养基4ml（低糖DMEM、10%胎牛血清、青霉素钠100U/ml、链霉素10

7、0μg/ml）的培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱中培养。3d后半量换液，以后每3d全量换液一次。培养的原代细胞12～14d铺满瓶底，用0.25%的胰酶消化，1000r/min离心6min，收集细胞，按1∶3的比例传代，命名为P1。P1传代细胞培养到铺满瓶底时消化、收集细胞再进行传代培养，命名为P2。　　1.2.2兔BMSCs的高密度微团诱导培养和分组　　P2传代细胞长满瓶底时，消化、收集细胞，用高糖DMEM悬浮，调整细胞浓度为1×106/ml。在每个60mm培养皿中各分布6滴细胞悬液，每滴100μl，在37℃、

8、饱和湿度、5%CO2的培养箱中静置2h后再缓慢加入诱导液。按加入诱导液的不同分为四组：A组：TGF-β110ng/ml+bFGF10ng/ml；B组：TGF-β110ng/ml+IGF-Ⅰ10ng/ml；C组：TGF-β110ng/ml；D组：空白对照组。四组均