兔主动脉脱细胞血管基质的制备论文

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1、兔主动脉脱细胞血管基质的制备论文林明山池一凡侯文明孙忠东牛兆倬孙勇生伟孙龙【摘要】目的研究脱细胞血管基质的制备方法。方法采用胰蛋白酶、低渗溶液、化学除垢剂联合法处理兔胸主动脉制备脱细胞血管基质,标本经苏木精伊红染色光镜观察，20g/L戊二醛固定做扫描电镜、透射电镜观察。结果光镜下血管脱细胞组织基质中胶原纤维和弹性纤维呈网状排列,细胞已全部除去;扫描电镜观察血管脱细胞组织基质纤维结构完整,胶原纤维无断裂,呈网状和多孔状,孔径（100～150）μm×（10～20）μm;透射电镜观察示胶原和弹性纤维无断裂,基底膜面光滑完整,无破裂。结论胰蛋白酶、低渗溶液、

2、化学除垢剂联合法处理兔主动脉,可使血管细胞全部脱除,胶原纤维、弹性纤维无断裂，细胞外基质保持完好。【关键词】细胞外基质;主动脉；胰蛋白酶目前,应用组织工程技术制备血管移植材料成为血管移植手术研究的热点1，2。组织工程血管的制备主要包括血管支架材料的研制、体外细胞培养和种植。可以用作组织工程血管的支架材料主要有体内可降解的人工合成材料和从天然组织中制备获得的材料。人工合成材料如聚乙二醇酸(PGA)、聚丙醇酸(PLA)等,有较好的生物相容性、可塑性和可降解性,但其工艺复杂。从天然组织中制备获得的材料如血管脱细胞组织基质(ACTM)因含有特殊氨基酸序列等,.

3、freela公司)、体积分数0.01的TritonX100(Sigma公司)、10g/L十二烷基硫酸钠(SDS,Sigma公司)、磷酸盐缓冲液(Sigma公司)、Hank’s液(Sigma公司)。1.2实验方法1.2.1动物血管采取家兔耳缘静脉注射空气致死，无菌条件下开胸取其胸主动脉,长8cm,直径0.35cm，置入培养皿中.freelL离心管中，加入含双抗的1.25g/L的胰蛋白酶6～8mL作用4h,然后用PBS冲洗3次,去离子水作用12h,体积分数0.01的TritonX100溶液作用24h,PBS冲洗3次，去离子水作用4h,最后采用10g/L

4、的SDS作用24h,PBS冲洗3次,含双抗的Hank液冲洗4h后保存。以上步骤均在37℃恒温震荡器中进行。1.2.3脱细胞血管基质的观察将制取的脱细胞血管基质用40g/L的甲醛固定，苏木精伊红染色，光镜观察细胞脱除情况;用20g/L的戊二醛固定,扫描电镜、透射电镜观察细胞脱除情况及胶原纤维和弹性纤维情况。2结果2.1大体观察血管剥除外膜后，管壁弹性良好，管腔无塌陷，内膜面光滑完整。脱细胞处理后，血管呈乳白色，管壁无破损，管腔无塌陷。2.2光镜观察处理前的血管壁中有大量核蓝染的细胞存在,亮红色、波浪状平行排列的胶原纤维清晰可见。血管脱细胞组织基质中胶原

5、纤维和弹性纤维保持原来的形态和结构,呈网状排列,其中细胞已全部被除去(图A、B)。2.3扫描电镜观察血管脱细胞组织基质纤维结构完整,胶原纤维无断裂,呈网状和多孔状,孔径（100～150）μm×（10～20）μm(图C、D)。2.4透射电镜观察胶原、弹力纤维呈网状排列,纤维无断裂,基底膜面光滑完整,无破裂(图E、F)。3讨论合适的支架材料对于构建组织工程血管十分重要,脱细胞血管基质是采用动物血管,经脱细胞处理后而获得的一种生物材料,它不仅去除了血管原有的免疫原性，保持了血管的原有形态和物理性能,而且保存了细胞识别的结合位点,易于种子细胞的种植和吸附4～6

6、。目前,脱细胞组织基质已应用于膀胱、口腔黏膜、骨等器官的重建7～9。1990年,支架,经多步骤的脱细胞处理,组织中的可溶性蛋白及细胞成分被除去,保留下来的是具有完整外观形态和组织学及超微结构的不可溶成分,主要包括胶原、弹性蛋白、氨基葡聚糖、结构蛋白等。脱细胞的方法主要有酶消化法和去污剂法。本文采用酶、低渗溶液和化学除垢剂联合的方法,多步骤处理血管获得脱细胞血管基质:先用胰蛋白酶对血管壁中的某些基质进行溶解，破坏其细胞的完整性，然后用低渗溶液进一步导致细胞溶胀、破裂11。BOOTH等12仅用0.3g/L的SDS就能将心脏瓣膜中的细胞完全除去,且胞外基质保

7、存完好。RIEDER等13的研究也表明，使用1g/L的SDS制备的脱细胞血管基质由于细胞毒性过大,细胞根本无法在上面存活。本实验采用TritonX100和10g/L的SDS联合脱细胞的方法,以完全脱除细胞和最大程度降低SDS的细胞毒性。本实验将TritonX100放在SDS之前应用,是因为SDS为离子型去垢剂,脱细胞效果强,短时间内大量细胞破裂后释放的蛋白酶较多,从而引起较多的蛋白纤维损伤,影响血管的结构和力学特性,故使用柔和的非离子型去垢剂TritonX100先去除部分细胞及内在的蛋白酶,使细胞内的蛋白酶不至于短时间内大量释放,降低胶原纤维、弹

8、力纤维的损伤；应用TritonX100，通过其上的亲水基团而溶解细胞膜,清除部分蛋白酶；最后