应用表面活性剂及磷脂酶制作猪脱细胞角膜基质的研究

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1、中山大学博士学位论文应用表面活性剂及磷脂酶制作猪脱细胞角膜基质的研究姓名：周杨申请学位级别：博士专业：眼科学指导教师：王智崇20090524◇中山大学博士学位论文应用表面活性剂及磷脂酶制作猪脱细胞角膜基质的研究应用表面活性剂及磷脂酶制作猪脱细胞角膜基质的研究中山大学中山眼科中-心专业博士研究生导师摘要目的眼科学周杨王智崇教授本研究旨在探索制作天然脱细胞角膜基质的方法和可行性，为组织工程提供理想的载体材料和眼表组织修复提供理想的修复材料。通过应用表面活性剂(十二烷基磺酸钠SDS及TritonX—loo)和磷脂酶A：(PLA2)处理猪角膜组织，以不同浓度和作用时间分组，确

2、定能够脱去角膜各层内的细胞同时可以最大限度保持角膜基质空间结构的处理条件作为合理的角膜脱细胞作用条件；通过对完成脱细胞的角膜基质其物理学特性及生物学特性的检测，探讨脱细胞基质作为角膜组织工程支架材料的可行性及安全性；将脱细胞基质植入兔角膜层间，观察术后角膜透明性的恢复，探讨该种基质作为角膜修复材料的有效性及其具体的作用机制，最终为眼表损伤的治疗提供科学的实验依据。方法1．借助阴离子表面活性剂进行猪角膜脱细胞基质的制备及最佳处理方案的确定：取新鲜猪角膜若干，分别用SDS及TritonX-100处理，共分为四组：实验一组(脱细胞真皮ADM—CACM组)—借鉴真皮组织脱细胞

3、的方法对角膜进行处理；实验二组◇中山大学博士学位论文应用表面活性剂及磷脂酶制作猪脱细胞角膜基质的研究(TritonX-100组)一单独使用TritonX-100处理角膜片，溶液浓度设定为0．1％、0．25％及0．5％，作用时间为6d,H寸、12d"时及24d,时；以不同的浓度及作用时间进行组合，共分为9组；实验{组(SDS组)一室温．卜．使用SDS处理角膜，溶液浓度设为0．05％、0．1％及0．5％，作用时问64,时、12d,时、24d,时，亦分为9组：实验网组一根据对上述实验三组结果的观察，选择浓度为0．I％SDS在37℃下分别作用2-9d,时，每l小时作为1个观察

4、点，共分为8组；组织学检查显示以浓度为0．1％的SDS溶液在37℃处理7d,时后，角膜原有的三维显微空问结构保留良好，基质片内无细胞成分残留；遂以此处理条件得到的脱细胞角膜片(SDS弋ACM组)进行后续检测；2．脱细胞角膜基质物理学特性的鉴定：从SDS-CACM，ADM-CACM，PBS—CACM三组中，每组随机抽取相同厚度的12只角膜基质片，分别将三组植片固定于紫外一可见光谱仪密闭的样品仓中，选择250nm-800nm作为观测的波长范围，连续测定两组植片的透光率；每组随机抽取24只角膜基质，置于50℃烘箱里烘干24小时，电子天平测其恒重G，后浸入PBS缓冲液，在角膜

5、片吸水后的不同时段取出，称重为G1；吸水率测量分为二组，每组12只。第一组测量时间持续2小时，每问隔lO分钟测量1次；第二组测量持续时间12小时，每间隔l小时测量1次，计算吸水率；上述三组角膜片按lcm2试样表面积加lOmL细胞培养液的比例在37。C的培养箱内浸提24小时，用MTT法评价各组植片对细胞生长活性的影响。3．脱细胞基质力学特性的鉴定：模拟正常角膜的结构制作力学模具，从SDS—CACM，ADM—CACM，PBS。CACM三组和空白组中每组随机抽取12只角膜基质，通过充气一破裂实验的结果，选择SDS．CACM，PBS—CACM和空白组角膜片每组12只进行应力一

6、应变实验，将拍摄所得数据输入电脑，测量并计算逐渐加压后角膜中央区标记范围内的面积变化，计算在5、15、30、50mmltg压力差(P’)时角膜片面模量(E)的变化，分析并比较不同组别角膜植片的应力一应变关系的差异。4．异种角膜基质层问植入术后透明性的恢复：成年新西兰大白兔60只，SDS—CACM组脱细胞角膜片30只，实验组30只眼，右眼行角膜基质层间异种材料植入手术，阴性对照组30只眼，右眼仅行角膜基质板层分离术。异种植片植入术后每日以裂隙灯观察术眼眼表情况、切口处的恢复以及脱细胞植片和宿主II◇中山大学博士学位论文应用表面活性剂及磷脂酶制作猪脱细胞角膜基质的研究角膜

7、透明度的恢复。于术后I周、2周、3蒯、4周随机处死实验组及对照组每组各20只兔子，制成石蜡标本行光学显微镜观察，监测术后植片4j宿辛的牛物卡H容性及透明度变化。取上述两组石蜡标本制成6lam切片，行人狼犀红一箭味酸染色，偏光显微镜’卜．观察术后卜4周宿丰角膜基质与植片角膜荩质内I型及III型胶原的数量变化，定性分析两种类型胶原在角膜创伤修复过程中的动态演变。异种植片植入术后1月、4月、7月及11月，处死动物实验组及对照组每组剩余的10只兔子，取其术眼行透射电子显微镜观察植入术后胶原纤维极层的排列情况，计算移植术后胶原纤维的直径及纤维之问的间距变化。5