血清反应因子促进人腹膜间皮细胞的转分化.pdf

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1、细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmuno1)2014，30(5521·论著·文章编号：1007—8738(2014)05—0521—04血清反应因子促进人腹膜间皮细胞的转分化梁维一，娄未娟，车明文，陈景荷，何丽洁，王汉民(第四军医大学西京医院肾脏内科，陕西西安710032；西安市第九医院肾脏内科，陕西西安710054)[摘要]目的探讨血清反应因子(SRF)在人腹膜间皮细胞(HPMC)转分化中的作用。方法腹膜间皮细胞由腹膜透析(PD)患者透出液离心后进行培养，观察不同透龄患者的原

2、代腹膜间皮细胞改变，并用免疫荧光细胞化学方法检测SRF及0【平滑肌肌动蛋白(Ot-SMA)、Snail、E-钙黏素(E．cadhenn)的表达。细胞经高糖刺激发生转分化后，将SRFsiRNA转染至细胞中使SRF下调，用免疫荧光细胞化学技术及Westernblot法检测E．eadherin和．SMA、Snail的表达。采用染色体免疫共沉淀(CHIP)及报告基因方法检测SRF与Snail的结合情况。结果无菌收集50例PD患者透出液，原代培养HPMC，随着透析时间的延长，细胞从铺路石样逐渐转变为成纤维

3、细胞样；SRF表达显著增强时，间质标志分子—SMA的表达增强，而上皮标志分子E-eadherin表达减弱。永生化的HPMC经高糖刺激72h使其发生转分化后，用小干扰RNA使SRF沉默。与对照组相比，免疫荧光细胞化学染色显示SRF下调后，Ot．SMA、Snail的表达明显减弱，而E．cadhefin表达明显增强；Westernblot结果显示SRF的表达水平降低时，E-eadherin表达升高，而—SMA、Snail的表达明显减少。ChIP结果提示，SRF可与Snail启动子区2个结合位点SRE1

4、和SRE2结合，报告基因结果显示，SRF主要与SRE2位点结合并启动snajl的表达。结论SRF在已发生间充质转分化的HPMC或腹膜纤维化时高表达，可能通过启动Snail表达来促进HPMC转分化。[关键词]上皮间质转分化；血清反应因子；E-钙黏素；平滑肌肌动蛋白[中图分类号]R459．5，R392．33，Q254[文献标志码]A腹膜透析(peritonealdialysis，PD)是终末期肾脏HPMC的EMT及腹膜纤维化过程中SRF的作用。疾病的替代疗法之一，但长期腹膜透析可以改变腹膜的结构和功

5、能，最终导致腹膜纤维化J。已有研1材料和方法究发现：人腹膜间皮细胞(humanpefitone~mesothelial1．1材料人腹膜透析液标本取自西京医院腹膜透析中心；cell，HPMC)的上皮间质转分化(epithelial—to—转染试剂LipofeetamineTM2000购自Invitrogen公司，兔抗人mesenehymaltransition，EMT)是腹膜纤维化的重要机E-eadherin多克隆购自Bioworld公司，兔抗人SRF抗体、兔抗制之一_2。成纤维细胞的积聚，过量的

6、胶原蛋白和人Snail抗体、兔抗人B-actin、SRFsiRNA购自SantaCruz公其他基质成分在慢性炎症部位堆积导致疤痕组织形司，兔抗人SMA多克隆抗体购自Epitomics公司。FITC标成和组织损伤，最终导致腹膜纤维化J。然而参与记的山羊抗兔IsG购自上海碧云天生物技术有限公司，辣根EMT过程中的具体分子及其机制尚不完全清楚。血过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购自北京中杉金桥公司。清反应因子(serumresponsefactor，SRF)是细胞骨架1．2方法的一个主要调控因素，细胞骨架

7、蛋白维持细胞形状、1．2．1HPMC的鉴定、培养与分组夜间留腹PD透出液标细胞黏附及细胞运动性，因此在血管生成中起着重本无菌操作收集约1500～2000mL，1200r／min离心5min，要的作用，SRF它还可引起细胞的增殖、迁移和分弃上清，洗涤2次，加入150mL／L胎牛血清(fetalbovine化J，在几种类型的癌症发生和发展中起着中心作serum，FBS)-DMEM／F-12培养液，接种于25em培养瓶中，用J，在HPMC的EMT过程中，SRF是否参与37~C、50mL／LCO培养箱中

8、培养，24h后首次换液，以后每HPMC的EMT过程及其是否促进了腹膜纤维化，目48h换液1次。用含10mL／LFBS的RPMI1640培养液将永前并不清楚。本实验通过免疫荧光细胞化学技术、生化腹膜间皮细胞培养24h后随机分为对照组和高糖组，葡Westernblot等方法观察SRF及上皮性钙黏素萄糖浓度分别为5．6mmol／L和60mmol／L。细胞均培养48h。(E—cadhefin)和仅平滑肌肌动蛋白(Ot-smoothmuscle经倒置相差显微镜观察腹膜间皮细胞呈多边形，似铺路石或actin