人腹膜间皮细胞的体外培养

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1、人腹膜间皮细胞的体外培养【摘要】目的：建立简便有效的人腹膜间皮细胞（HPMC）的体外培养方法。方法：用0.2%胰蛋白酶-0.02%EDTANa2消化人大网膜组织，细胞悬液经100目筛网滤过后进行培养。用形态学、免疫组化（SP法）鉴定细胞。结果：分离培养的细胞光镜下呈铺路鹅卵石状。免疫组化鉴定显示角蛋白、波形蛋白抗原阳性，第Ⅷ因子、白细胞CD45抗原阴性，证实培养的细胞的确是HPMC。结论：胰蛋白酶消化法是一种简单实用的分离HPMC的方法。【关键词】腹膜间皮细胞；胰蛋白酶；大网膜腹腔粘连是腹部手术后常见的并发症，常引起肠梗阻、

2、慢性腹痛，以及不孕、不育等，而且粘连很难通过再次手术加以改善[1]。近年来对腹腔粘连的形成机制有了较深入的研究，认为腹腔粘连的形成与多种因素有关，其中腹膜间皮细胞的完整性及功能正常与否是腹腔粘连形成的关键因素[2]。因此，建立人腹膜间皮细胞培养体系，为体外研究人腹膜间皮细胞生理功能及其在腹腔粘连防治中的作用提供了有效手段。早在20世纪80年代初，I-1640完全培养液终止消化。用移液器分装于10mL尖底离心管，1000r/min，离心10min，弃上清，加入适量完全培养液溶解细胞沉淀，分装于50mL培养瓶，放置于37℃，5%

3、CO2培养箱内培养。1.5腹膜间皮细胞的传代培养原代细胞培养24h后，镜下观察细胞贴壁情况，贴壁良好的以等体积的新鲜完全培养液替换瓶内全部陈旧培养液，贴壁情况差的以等体积的新鲜完全培养液替换瓶内一半的陈旧培养液，此后每3d全换液1次。约培养5~8d细胞生长融合，可以首次传代。当细胞生长融合成单层，PBS漂洗2次，每瓶加入完全消化液2mL，在37℃，5%CO2培养箱内消化15min。镜下观察细胞消化情况，细胞脱落变形后，加入4mL完全培养液终止消化。将细胞悬液分装于离心管内1000r/min，离心10min，弃上清，加入适量完

4、全培养液溶解细胞沉淀，传代于6孔板（将盖玻片裁成4片，泡酸，洗净，烘干，在盛有多聚赖氨酸的塑料培养皿内浸泡5~10min，取出，在干燥箱内60℃烘干1h，高压灭菌。将灭菌后的盖玻片放置于6孔板内，每孔3片）内，加入适量完全培养液。继续在37℃，5%CO2，湿度95%的培养箱中静置培养，至细胞完全贴壁伸展。1.6腹膜间皮细胞的鉴定1.6.1免疫组化鉴定①吸去6孔板内培养液，PBS（pH7.2~7.4）洗2次，每次3min，将细胞爬片取出，用生理盐水洗2遍，随即放入10%中性福尔马林固定30min；蒸馏水洗4次，每次3min。②

5、加入0.1%TritonX100（PBSpH7.4配制），室温10min，PBS洗3次。③抗原修复，根据不同一抗的要求进行（CD45无须修复，波形蛋白和第8因子用柠檬酸缓冲液高压加热修复。滴加即用型一抗、室温下孵育60minBPS洗3次每次5min，去除PBS。每张盖玻片滴加50LElivision试剂盒中的试剂A，室温下20min，PBS洗3次，每次3min。每张盖玻片滴加50LElivision试剂盒中的试剂B，室温下30min，BPS洗4次，每次5min）。④DAB显色，每张盖玻片滴加新鲜配置的DAB显色溶液，在显微镜

6、下观察3~10min；自来水洗5min，苏木素复染，0.1%盐酸分化，自来水冲洗，PBS返蓝。⑤脱水，逐级脱水：过70%、80%、90%、95%酒精各1次，100%酒精2次，每次1min；透明，过二甲苯溶液3次，每次3min。⑥封片，将有细胞的一面向下，用中性树胶封片。自然通风干燥。普通光学显微镜观察，拍照。1.6.2扫描电镜鉴定①细胞准备：同间皮细胞传代，取出细胞爬片浸入PBS中漂洗细胞表面；②固定：将细胞爬片放入青霉素小瓶中，加入4℃预冷的3%的戊二醛，4℃过夜。吸出固定液，用PBS浸洗2次，每次10min。再加入4℃预

7、冷的1%的四氧化锇，在4℃固定1h。PBS浸洗2次，每次10min。③脱水：用30%、50%、70%、80%、90%、100%酒精逐级脱水，各10min。④置换：将样品放入醋酸异戊醋:丙酮=l:1的混合液中10min，然后放入醋酸异戊酯中2次，各10min；⑤临界点干燥：预冷临界点干燥室的样品室，使其温度降到0℃，将玻片放入样品篮，样品篮的上下两面事先铺好滤纸，在保证细胞被醋酸异戊醋浸润的情况下，将样品篮放入样品室。拧紧室盖，充入液态CO2，同时缓慢排出CO2气体，反复3次，使液态CO2置换出细胞中的醋酸异戊醋，加热样品室，

8、使CO2达到临界状态。缓慢的排出CO2，待样品室压力降为零，取出样品。⑥离子溅射镀膜：从样品篮中取出玻片，用银胶将干燥样品粘到样品托上。导电胶干燥后，将样品托放入离子溅射仪的真空罩内，抽真空。当真空度达0.1托后，加高压1000V，离子溅射镀膜。⑦电镜观察：启动扫描电镜，安装样品，观察细胞