医学毕业论文葛根素对体外培养人腹膜间皮细胞保护作用的研究

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1、葛根素对体外培养人腹膜间皮细胞保护作用的研宄姓名：2014年6月25日葛根素对体外培养人腹膜间皮细胞保护作用的研宄【摘耍】目的:了解葛根素对体外培养的人腹膜间皮细胞增殖活性、氧化应激和转移生长因子Pl(TGFpi)分泌的影响。方法:体外培养人腹膜间皮细胞，分对照组，腹膜透析液(PDS)组及葛根素1、2、3组(葛根素终浓度依次为50、100、200ggml-l)5组观察。检测各组间皮细胞的增殖活性，上清MDA、SOD、GSH水平以及TGFpi的含量并进行比较。结果:在PDS干预下腹膜间皮细胞MTT还原能力明显下降，上清液MDA水平较对照组显著升高，SOD、GSH水平较对照组显著降低。葛根素组

2、MDA水平显著低于PDS组，SOD、GSH水平显著高于PDS组。腹膜间皮细胞在PDS干预卜‘分泌TGFpi较对照组显著堉加，葛根素组TGFpi分泌与PDS组比较奋显著下降。结论:葛根素可以拮抗商业性PDS对腹膜间皮细胞增殖活性的抑制作用，可以抑制氧化应激和TGFpi分泌。【关键词】葛根素；人腹膜间皮细胞；转移生长因子pi;腹膜透析液；氧化应激腹膜透析是终末期肾病患者首选的肾脏替代治疗方式之一［1］。然而随着透析时间的延长，腹膜纤维化形成成为导致患者腹膜功能丧失和透析退出的主耍原因。研宄衷明，腹膜透析液(peritonealdialysissolution,PDS)的生物不相容性导致的腹膜间

3、皮细胞损伤是腹膜纤维化发生的起始因素。有效保护腹膜间皮细胞能够阻止或延缓腹膜纤维化的进展，给腹膜透析患者带来益处。我们通过观察葛根素对腹膜间皮细胞增殖活性、氧化应激以及转移生长因子(31(TGFpi)分泌的影响，明确葛根素是否具有拮抗PDS对腹膜间皮细胞的损伤，从而保护腹膜间皮细胞，发挥潜在的抗腹膜纤维化作用。1材料与方法1.1材料2.5%BaxterPDS为广州百特医疗用品公司产品，pH5.2,内含葡萄糖0.139moLL-l、乳酸4.97nwLL-l;葛根素注射剂为浙江康恩贝制药股份有限公司产品，规格250mg•支-1;磷酸盐缓冲液（PBS）、胎牛血清（FBS）、RPMI1640粉剂以

4、及胰蛋白酶等购GIBCO公司；TGFpiELISA检测试剂盒购&晶美生物有限公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）、二甲亚砜（DMSO）为Sigma公司产品;GSH、SOD、MDA检测试剂盒购自南京建成牛.物工程研究所；微量蛋白BCA检测试剂盒购自碧云天生物有限公司；抗细胞角蛋白抗体、抗波形蛋白抗体、第八因子抗体和抗白细胞CD45抗体购自北京中山生物技术有限公司；完全培养基为含20%FBS、105UL-1青霉素和lOOpgml-1链霉素的RPMI1640培养液。全自动酶标仪（Sunrise）为Biobank公司产品。1.2方法1.2.1人腹膜间皮细胞的分离、培养与鉴定取非尿毒症和糖尿病择期手术病人

5、（n=5）的网膜作为间皮细胞来源，按文献［2］方法培养人腹膜间皮细胞。当细胞生讼融合成单层时用0.25%胰酶0.01%EDTA消化，按1:3传代，第3代用于实验。传代细胞经倒置显微镜观察和免疫组化抗细胞角蛋白抗体、抗波形蛋白抗体染色阳性，抗第八因子抗体和抗白细胞CD45抗体染色阴性鉴定。1.2.2细胞增殖活力检测（MTT法）用含20%FBS的RPMI1640培养液将第2代消化细胞重悬成lxl05ml-l的细胞悬液。置96孔培养板培养，每孔200（il,当细胞融合度达到80%左右时，用含0.1%FBS的RPMI1640培养液同步24h后分5组观察，每组设2个复孔。对照组为加入RPMI1640

6、与完全培养基各100

7、il,PDS组为加入PDS与完全培养基各100卜山葛根素1、2、3组分别为含葛根素100、200、400Mg，ml-l的PDS与完全培养基各100gl,葛根素终浓度依次为50、100、200

8、^gml-l；37°C、5%CO2培养箱培养48h后弃上清，以完全培养基100pl和浓度为5mgTnl-1的MTT（以0.1mol,pH7.2的PBS配制）100（il加入培养孔中继续培养3h，弃上清液，每孔加入DMSO200pl震荡混匀，取100（11加入96孔板在492nm处测吸光度（A）值，参考值为620mn，以A值表示间皮细胞活性。1.2.3氧化应激指标检测消化第2代融合

9、细胞，用含20%FBS的RPMI1640培养液重悬细胞（细胞浓度为lxl05ml-l），接种24孔培养板培养，每孔0.5ml,当细胞融合度达到80%左右时，用含0.1%FBS的RPMI1640培养液同步24h后分5组观察，每份做3批次，设1个复孔。对照组加入RPMI1640与完全培养基各0.5ml,葛根素1、2、3组分别为含葛根素的PDS与完全培养基各0.5ml,葛根素终浓度同前。37°C、5%CO2培养箱培养48h,上