人腹膜间皮细胞的体外培养论文

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1、人腹膜间皮细胞的体外培养论文【摘要】目的：建立简便有效的人腹膜间皮细胞（HPMC）的体外培养方法。方法：用0.2%胰蛋白酶-0.02%EDTANa2消化人大网膜组织，细胞悬液经100目筛网滤过后进行培养。用形态学、免疫组化（SP法）鉴定细胞。结果：分离培养的细胞光镜下呈铺路鹅卵石状。免疫组化鉴定显示角蛋白、波形蛋白抗原阳性，第Ⅷ因子、白细胞CD45抗原阴性，证实培养的细胞的确是HPMC。结论：胰蛋白酶消化法是一种简单实用的分离HPMC的方法。【关键词】腹膜间皮细胞；胰蛋白酶；大网膜腹腔粘连是腹部手术后常见的并发症，常引起肠梗阻、慢性腹痛，以及不孕、不育等，而且粘连很难通过再次手术加以改善

2、1。近年来对腹腔粘连的形成机制有了较深入的研究，认为腹腔粘连的形成与多种因素有关.freelL培养瓶，吸管，10mL尖底离心管，CO2培养箱，超净台，离心机，倒置相差显微镜，100目不锈钢筛，0.22滤膜过滤器。1.3主要试剂1.3.1PBS液氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.56g，磷酸二氢钾0.2g溶于1000mL三蒸水中，过滤灭菌分装，室温保存。1.3.21640培养基InvitrogenCorporation公司产品，按说明配制，并使其含有青链霉素各100U/mL，小牛血清20%。1.3.3细胞消化液胰蛋白酶（国药集团化学试剂有限公司）2.5g，EDTA二钠盐0.16

3、g溶于1000mLPBS液中，过滤除菌，分装于小瓶内，-20℃保存。1.3.4免疫组化抗体波形蛋白抗体，第8因子抗体，CD45抗体均为福建迈新公司产品。1.4腹膜间皮细胞的原代培养无菌摘取腹部手术切除的大网膜，剪取血管脂肪相对少的网膜组织，大小约3cm×3cm，将剪取的网膜组织置于含500U/mL青霉素和500L/mL链霉素的无菌生理盐水中浸泡20min，然后用生理盐水流动冲洗5min，将漂洗后的网膜组织平铺于无菌培养皿内，再用PBS反复漂洗至没有油珠漂浮，同时剪除血管及脂肪，将洗净的网膜组织剪成1cm×1cm大小，加入0.2%胰蛋白酶-0.02%EDTA细胞消化液20mL，用吸管反复吹

4、打均匀，装于50mL培养瓶内，放置于37℃，体积分数为5%CO2培养箱内消化25min，每5min振摇1次，最后5min保持静止。消化结束后将消化液用100目不锈钢筛过滤于培养皿内，加入等量含20%体积分数的胎牛血清的RPMI-1640完全培养液终止消化。用移液器分装于10mL尖底离心管，1000r/min，离心10min，弃上清，加入适量完全培养液溶解细胞沉淀，分装于50mL培养瓶，放置于37℃，5%CO2培养箱内培养。1.5腹膜间皮细胞的传代培养原代细胞培养24h后，镜下观察细胞贴壁情况，贴壁良好的以等体积的新鲜完全培养液替换瓶内全部陈旧培养液，贴壁情况差的以等体积的新鲜完全培养液替

5、换瓶内一半的陈旧培养液，此后每3d全换液1次。约培养5~8d细胞生长融合，可以首次传代。当细胞生长融合成单层，PBS漂洗2次，每瓶加入完全消化液2mL，在37℃，5%CO2培养箱内消化15min。镜下观察细胞消化情况，细胞脱落变形后，加入4mL完全培养液终止消化。将细胞悬液分装于离心管内1000r/min，离心10min，弃上清，加入适量完全培养液溶解细胞沉淀，传代于6孔板（将盖玻片裁成4片，泡酸，洗净，烘干，在盛有多聚赖氨酸的塑料培养皿内浸泡5~10min，取出，在干燥箱内60℃烘干1h，高压灭菌。将灭菌后的盖玻片放置于6孔板内，每孔3片）内，加入适量完全培养液。继续在37℃，5%CO

6、2，湿度95%的培养箱中静置培养，至细胞完全贴壁伸展。1.6腹膜间皮细胞的鉴定1.6.1免疫组化鉴定①吸去6孔板内培养液，PBS（pH7.2~7.4）洗2次，每次3min，将细胞爬片取出，用生理盐水洗2遍，随即放入10%中性福尔马林固定30min；蒸馏水洗4次，每次3min。②加入0.1%TritonX100（PBSpH7.4配制），室温10min，PBS洗3次。③抗原修复，根据不同一抗的要求进行（CD45无须修复，波形蛋白和第8因子用柠檬酸缓冲液高压加热修复。滴加即用型一抗、室温下孵育60minBPS洗3次每次5min，去除PBS。每张盖玻片滴加50LElivision试剂盒中的试剂A

7、，室温下20min，PBS洗3次，每次3min。每张盖玻片滴加50LElivision试剂盒中的试剂B，室温下30min，BPS洗4次，每次5min）。④DAB显色，每张盖玻片滴加新鲜配置的DAB显色溶液，在显微镜下观察3~10min；自来水洗5min，苏木素复染，0.1%盐酸分化，自来水冲洗，PBS返蓝。⑤脱水，逐级脱水：过70%、80%、90%、95%酒精各1次，100%酒精2次，每次1min；透明，过二甲苯溶液3次，每次3mi