过表达e-钙粘蛋白对tgf-β诱导的腹膜间皮细胞转分化的影响

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1、中图分‘类号垦鱼鱼星!鱼分类号UDC610硕士学位论文学校代码10533过表达E一钙粘蛋白对TGF-13诱导的腹膜间皮细胞转分化的影响Effectofover-expressionofE—cadherinonepithelial—mesenchymal—transitionthatinducedbyTGF—13linperitonealmesothelialcells作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：副指导老师：杨淼临床医学内科学湘雅三医院张浩教授张柯主治医师答辩委员会主中南大学2013年5月原创性声明JIllllllJllHUlllIIIIIUJ

2、Y2421538本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式表明。作者签名：物盏日期：趔上键月上三日学位论文版权使用授权声明本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文，允许学文论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论过表达E一钙粘蛋白对TGF．13诱导的腹膜间皮细胞转分化的影响摘要目的：E．钙粘蛋白(E—cadherin，E．cad)质粒(plRES2．EGFP．EC

3、AD)转染人腹膜间皮细胞永生化细胞株(如出SV5)，观察E．cad的过表达对腹膜间皮细胞上皮细胞．间充质转分化(Epithelial—MesenchymalTransition，EMT)的影响。方法：(1)采用大肠杆菌DH5a进行plRES2一EGFP．ECAD质粒及空白质粒(Vector)扩增，酶切鉴定，RT-PCR验证。(2)体外培养HMrSV5，将HMrSV5分为正常对照组、E—cad转染组、空质粒转染组，通过脂质体转染法(1ipLTX)转染plRES2．EGFP—ECAD质粒及空质粒，倒置显微镜下观察细胞形态学的变化：流式细胞术评估转染效率，采用RT-PCR、W

4、esternBlot分别观察转染后12h、24h、36h、48h、72hE．cad的rnRNA及蛋白表达。(3)将HMrSV5分为正常对照组、TGF．13刺激组，采用WesternBlot、细胞免疫荧光观察TGF．B刺激后12h、24h、36h、48hE．cad、a-SMA的蛋白表达；验证TGF．p刺激对HMrSV5EMT的影响。(4)将HMrSV5分为正常对照组、TGF．p刺激组、pIRES2-EGFP．ECAD质粒转染+TGF—p刺激组，通过脂质体转染法(1ipLTX)转染plRES2一EGFP．ECAD质粒，并分别给予TGF．p刺激，采用RT-PCR检测转染+刺激

5、(或单纯刺激)后12h、24h、36h、48hE．cadmRNA的表达，采用WesternBlot方法检测转染+刺激及单纯刺激后12h、24h、36h、48hⅡ．SMA、Vimentin的蛋白表达；采用细胞免疫荧光方法检测转染+刺激(或单纯刺激)后12h、24h、36h、48hE．cad、仅一SMA的蛋白表达，观察E—cad的过表达对TGF．B诱导的HMrSV5EMT的影响。结果：(1)扩增质粒经限制性内切酶酶切电泳鉴定，RT-PCR证实，扩增质粒序列无突变。(2)plRES2．EGFP．ECAD质粒转染HMrSV512h细胞内E—cadmRNA表达量最高，随后逐步下降

6、，与正常对照组比较有差异(矿O．05)，转染后12h细胞内E．cad表达开始上调，36小时达到峰值，随后逐渐下降，与正常对照组及空质粒转染组比较均有显著差异(∥0．01)。(3)TGF．p刺激HMrSV5后，细胞内仅一SMA表达逐步上调，呈时间依赖性趋势，与正常对照组相比有显著差异(p

7、刺激诱导的HMrSV5表型转分化。图14幅，表0个，参考文献3l篇关键词：人腹膜间皮细胞株；E一钙粘蛋白：转染；TGF'-11刺激：上皮细胞间充质转分化分类号：610Effectofover-expressionofE—cadherinonepithelial—mesenchymal—transitionthatinducedbyTGF—pinperitonealmesothelialcellsAbstract：Objective：TotransfectwinlE—cadherinplasmid(pIRES2-EGFP-ECAD)into