资源描述：
《hsa-mir-520真核表达载体的构建及对E-钙粘蛋白表达的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、hsa-mir-520真核表达载体的构建及对E-钙粘蛋白表达的影响张潞渝作者介绍：张潞渝，男，实验师研究方向：分子医学与肿瘤通讯作者：武卫华，E-mail:wuwh77@gmail.com叶彬，电话：02368485898孔璟2高剑2叶彬1,2武卫华1,2刘革力1（1.重庆医科大学分子医学与肿瘤中心，重庆400016;2.重庆医科大学基础医学院病原生物学教研室，重庆400016）摘要:目的构建hsa-mir-520真核表达载体，并转染大肠癌细胞SW-480细胞，检测细胞中E-钙粘蛋白表达情况。方法依据miRBase数据库中hsa-mir-520序列，设
2、计并合成寡核苷酸片段，构建hsa-mir-520表达载体和对照载体。采用脂质体转染方法分别将mir-520表达载体、及对照质粒转染大肠癌细胞SW-480细胞株。采用酶切、测序检测载体构建；WeshernBlot检测E-钙粘蛋白的表达。结果酶切和测序表明hsa-mir-520真核表达载体构建成功。WeshernBlot结果显示与转染对照质粒和未转染的细胞相比，转染了hsa-mir-520重组质粒的细胞中E-cadherin蛋白的表达明显增加（P<0.01），密度扫描半定量分析显示E-cadherin蛋白的表达增加了大约40%。结论成功构建了hsa-mir
3、-520和对照的真核表达载体，hsa-mir-520质粒转染大肠癌细胞SW-480后可增加E-钙粘蛋白的表达。关键词：hsa-mir-520；E-钙粘蛋白中图分类号：R73-3；Q78Constructionofmir-520expressionplasmidanditseffectontheexpressionofE-cadheringeneZhangLuyu,KongJing,GaoJian,YeBinWuWeihua,LiuGeli（1.ChongqingMedicalUniversityChongqing4000162．Departmentof
4、PathogenBiology,ChongqingMedicalUniversityChongqing400016）微RNA（microRNA，miRNA）广泛存在于真核生物中，是一类由基因组编码的非编码RNA。MicroRNAs在细胞的多个过程如发育、增殖和凋亡中发挥着重要作用。microRNA可通过与靶mRNA的3′非翻译区3′UTR）序列不完全配对的方式对相应的蛋白编码基因进行转录后水平调控[[]StandartN,JacksonRJ.MicroRNAsrepresstranslationofm7Gppp-cappedtargetmRNAsinv
5、itrobyinhibitinginitiationandpromotingdeadenylation[J].GenesDev,2007,21(16):1975-1982.]。一般认为miRNAs通过沉默靶基因的表达来发挥作用[[]HeL,HannonGJ.MicroRNAs:smallRNAswithabigroleingeneregulation[J].Nat.Rev.Genet,2007,5(7):522–531]。有研究发现人工合成的dsRNAs和相应基因启动子区的结合可诱导基因表达，并将此现象称为RNA激活(RNAa)。RNAa诱导了表现型的
6、改变，靶基因的受到诱导而影响了下游基因的表达[[]LiLC,OkinoST,ZhaoH,etal.Smalldouble-strandedRNAsinducetranscriptionalactivationinhumancells[J].ProcNatlAcadSciUSA,2006,103(46):17337-17342.,[]JanowskiBA,YoungerST,HardyDB,etal.Activatinggeneexpressioninmammaliancellswithpromoter-targetedduplexRNAs.NatChe
7、mBiol,2007,3(3):166–173..]。如同RNAi,RNAa可操控基因的表达而改变细胞路径和改变细胞生理。然而，同RNAa类似，miRNAs也可能正向调控基因表达。E-钙粘蛋白(E-cadherin,CDH1)的功能活性及表达程度与肿瘤细胞脱离和再附着相关，在肿瘤浸润发展中起着重要作用。通过在线的RegRNA软件(availableathttp://regrna.mbc.nctu.edu.tw)比对后发现hsa-mir-520与E-cadherin启动子区中一段（1169-1196）序列互补。为检测miRNAs是否可诱导E-cadher
8、in基因表达，本实验构建hsa-mir-520真核表达载体，建立稳定转染hsa-mir-520
