脯氨酸特异内切酶的表达及酶学性质研究.pdf

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1、分类号Q2学校代码10590UDC576密级公开硕士学位论又脯氨酸特异内切酶的表达及酶学性质研究申请人姓名张童玲申请人学号2110180219专业名称细胞生物学导师姓名及职称刘士德教授、张建华讲师二•一五年五月十曰原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律后果由本人承担。论文作者签名：日期：206年艾月丨0日学位论文版权使用授权书(必须装订在印刷本首页）本

2、学位论文作者完全了解深圳大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属深圳大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其他机构送交论文的电子版和纸质版，允许论文被查阅和借阅。本人授权深圳大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(涉密的学位论文在解密后适用本授权书）论文作者签名：导师签名：<5曰期：20

3、^年玄月/G曰曰期年J分类号Q2学校代码10590UDC576密级公开深圳大学硕士学位论文脯氨酸特异内切酶的表达及酶学性质研究学位申请人姓名张童玲专

4、业名称细胞生物学学院（系、所）生命科学学院指导教师姓名刘士德张建华脯氨酸特效内切酶的异源表达及酶学性质研究摘要脯氨酸特异内切酶（ProlineSpecificEndopeptidases，EC3.4.21.26，PSEases）是一类特异性降解脯氨酸残基羧基端肽键的裂解酶。该酶分属于脯氨酰内肽酶类，广泛的分布于植物、哺乳动物、细菌和真菌体内，该类酶在结构上有较高的同源性，但其在催化机理及功能上却存在很大的差异。已有报道显示，不同生物体内的脯氨酰内肽酶的催化机制相差很大，即使在同一生物体内的不同器官和组织中，该类酶的作用机理也不相同。基于目前对该类酶的研究进展，以

5、及其应用价值的开发前景，寻求一种可以满足国内市场需求的生物酶，既是一种机遇，也是一种挑战。本研究委托生工生物工程（上海）有限公司合成了脑膜炎败血型黄杆菌（Flavobacteriummeningsepticum）的脯氨酸特异内切酶的cDNA片段。本研究将该基因连接到载体pGBTNH上，转化大肠杆菌BL-21star，获得了表达融合蛋白GB1-PSEase的重组菌。通过SDS-PAGE和Western-Blot检测发现，该融合蛋白的相对分子质量为84.5kDa，和理论值一致，通过镍离子柱亲和层析纯化了GB1-PSEase融合蛋白，并对其酶学性质进行了分析。本研究以

6、Z-Gly-Pro-pNA为底物，检测了GB1-PSEase的酶学性质，结果显示，GB1-PSEase降解Z-Gly-Pro-pNA的Km值为0.921mM/min，Vmax为0.666mM/min，最适pH为6.4，最适反应温度为37℃。本研究还发现，GB1-PSEase在高于pH6.4条件下的稳定性比低于pH5.0的条件下的稳定性高；在低于37℃时的稳定性比高于37℃时的稳定性高。本研究检测了不同金属离子对GB1-PSEase降解Z-Gly-Pro-pNA的影响，发现1mmol/L的Ca2+和Mn2+可以将GB1-PSEase的水解活力分别提高18.57%和

7、23.73%，1mmol/L的Mg2+、Cu2+、Ni2+和Zn2+则可以将GB1-PSEase的水解活力分别降低24.83%、4.55%、18.06%和43.05%；5mmol/L的Ca2+、Mg2+和Mn2+可以将GB1-PSEase的水解活力分别提高43.42%、8.44%和61.96%，而5mmol/L的Cu2+、Ni2+和Zn2+却可以将GB1-PSEase的水解活力分别降低55.73%、46.25%和43.05%。说明金属离子对GB1-PSEase水解活力的影响不仅与离子的性质有关，还与离子浓度有关。本研究检测了GB1-PSEase的贮藏稳定性，发现

8、GB1-PSEase冻干粉在4℃条件下存放3个月，其水解活力仅下降了9.57%，而液体状态下的GB1-PSEase水解活力则下降2脯氨酸特效内切酶的异源表达及酶学性质研究了37.44%，说明GB1-PSEase冻干粉更适合长久保存。关键词：GB1-PSEase；表达；酶学性质；稳定性3StudyonheterologousexpressionandenzymaticpropertiesofprolinespecificendopeptidaseAbstractProlineSpecificEndopeptidases（PSEases）aretheenzymest

9、hathydrolyze