耐碱性纤维素酶的表达纯化及酶学性质研究.pdf

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1、摘要耐碱性纤维素酶是一类在碱性环境下具有很高酶活性的纤维素酶，其在洗涤、纺织、饲料、印刷等领域有广泛应用。本论文以Cellulomonasbogoriensis为实验菌株，对其产酶条件进行优化，利用克隆表达获得两种内切型纤维素酶Cel619和Cel800，并对二者的酶学性质进行研究。利用单因素实验确定了实验菌株Cellulomonasbogoriensis产纤维素酶的最佳条件：培养时间3d、培养基初始pH值10.5、培养温度30℃、碳源2.5%（w/v）玉米秸秆、氮源2.0%（w/v）混合的酵母浸粉和牛肉膏（1:1）、装液量100mL/500mL、接种量为4.0%（v/

2、v）。对其粗酶性质进行初步研究，得到最适反应pH值为7.0，具有广泛的pH稳定性；最适反应温度为50℃，在40℃范围内有很好的温度稳定性。在NCBI中查找得到菌株Cellulomonasbogoriensis的全基因组DNA，其中有2种内切型葡聚糖酶，根据其基因序列设计引物，进行克隆与表达。对重组蛋白Cel619诱导表达，确定最佳诱导条件是：诱导温度16℃，IPTG浓度0.8mM。亲和层析得到Cel619和Cel800纯酶组分，分子量大小分别为66.5kDa和88kDa，酶的比活力分别是78.25U/mg和145.3U/mg。重组酶Cel619和Cel800的最适反应p

3、H值分别为5.0和7.0，pH值为10.0时酶的剩余活性皆达到40%以上，说明该重组酶为耐碱性纤维素酶；在pH5.0-11.0范围内，纤维素酶的剩余酶活力均在70%以上，表明该纤维素酶具有良好的pH值稳定性。最适反应温度分别为70℃和60℃，酶的温度稳定性良好，说明二者可能是耐高温酶。Cel619和Cel800对于某些金属离子和化学试剂表现出良好的耐受性，适当浓度的Na+/K+盐离子对二者酶活均有促进作用，且具有很好的耐盐性。Cel619对可溶性底物CMC的酶活最高，对于不溶性底物微晶纤维素也有一定的活性。Cel619的Km=11.33mg/mL，Vmax=166.67

4、µmol/min/mg。Cel800具有广泛的底物特异性，对可溶性底物CMC、木聚糖以及海带多糖均有很好的降解活性，其中对CMC的酶活最高，对于不溶性底物微晶纤维素和滤纸也有一定的降解活性。Cel800的Km=9.5mg/mL，Vmax=304.87µmol/min/mg。重组酶Cel619和Cel800具有耐高温、耐盐碱性以及对金属离子和有机试剂良好的耐受性，因此其在纺织业、洗涤业及环境保护等方面具有广阔的应用前景。关键词：耐碱性纤维素酶；Cellulomonasbogoriensis；发酵优化；克隆表达；酶学性质IAbstractAlkalitolerantcell

5、ulaseiscellulasehavinghighactivityinalkalineenvironment,whichhaswideapplicationinthewash,textile,feed,printingandotherfields.Inthispaper,CellulomonasbogoriensisasexperimentalstrainsIoptimizeditsenzymeproductionconditions,obtainedtwoendo-cellulaseCel619andCel800bycloningandexpression,andr

6、esearchtheirenzymaticproperties.BysinglefactorexperimentstodeterminetheoptimumconditionsforcellulaseproductionfromtheexperimentalstrainCellulomonasbogoriensis:cultivationtime3d,mediuminitialpH10.5,cultivationtemperature30℃,carbon2.5%(w/v)cornstover,nitrogen2.0%(w/v)ofyeastextractandmixed

7、beefextract(1:1),liquidvolume100mL/500mL,inoculationcontent4.0%(v/v).ItssimpleresearchofthecrudeenzymeshowedoptimumpHis7.0withawiderangeofpHstability;optimumreactiontemperatureis50℃withgoodtemperaturestabilityintherangeof4-40℃.IobtainedthewholegenomeDNAofstrainsCellulomon