嗜热子囊菌内切葡聚糖醋I基因的DNA改组及酶学性质的研究.pdf

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1、分类号：Q2墨密级：公珏单位代码：学号：100862008129嗜热子囊菌内切葡聚糖酶I基因的DNA改组及酶学性质的研究DNAshufflingofThermoascusaurantiacusEndo-p-glucanaseIGeneandthestudyofEnzymicProperties长会：c学箨申请人：白玉、。”指。导教师：郭润芳副教授!≮1学嚷}专业：微生物学学位类别：理学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二。一一年五月二十八日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的

2、地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑主垦盛些盘鲎或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：戗k签字日期：&。，，年f月3，El学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解塑皇垦壅些盘堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权塑兰堡盔些盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在

3、解密后适用本授权书)学位论文作者签名：瓴五导师签名：签字日期：劫，，年，月专，日签字日期：如『1年jfl月罗1日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：电话：邮编：摘要纤维素是地球上分布最广、蕴藏量最丰富的可再生资源。纤维素的利用与转化对于解决目前世界所面临的粮食短缺、环境污染以及能源危机等问题具有十分重要的意义。纤维素酶可以将纤维素水解成为葡萄糖，这是一条无污染且能有效利用纤维素的途径。但目前纤维素酶的成本仍较高，一些纤维素酶具有活性较低或热稳定性较差等缺点，通过定向进化可以不断提高并获得新性能的重组纤维素酶。本试验以嗜热子囊菌内切葡聚糖酶基因曙，为研究对

4、象，通过DNA改组技术对野生型馏，进行突变重组，以期获得高内切葡聚糖酶活性、高稳定性的突变菌株。本研究主要结果：1．通过优化DNaseI酶切时间、无引物PCR和有引物PCR的模板量等关键因素，建立适合于嗜热子囊菌内切葡聚糖酶基因改组的条件。2．以质粒pMD．18T-egI为模板进行PCR扩增，获得野生型曙，，利用DNAshuffling技术，得到大约400个突变克隆，随机挑选20株进行测序和序列分析，突变率达0．11％加．43％。3．将含有突变基因的重组质粒pMD．18T-egI和酵母表达质粒pPIC9K用SnaBI、NotI进行双酶切，经T4DNA连接酶连接，

5、转化大肠杆菌DH5a，抽提质粒，获得携带不同片段的质粒。线性化后，采用LiCl转化方法转入毕赤酵母GSll5感受态细胞中，MD平板上筛选Mut+His+转化子。阳性转化子在基础盐培养基中诱导表达，经酶活测定，筛选出1株活性较高的菌株BY2，酶活为23．75U／mL，比出发菌株酶活提高了将近10倍。4．为得到高表达基因工程菌株，提取这株突变菌的基因组，以EG．S和EG-A为引物扩增该突变基因，序列分析发现该突变株为13号突变基因。突变基因与pPIC9K连接，线性化后进行电击转化。通过活性筛选，得到高活性突变体BY213，在基础盐培养基中培养168h后，酶活可达到7

6、8．63U／ml，蛋白含量达到1．14mg／mL。表达产物经SDS．PAGE电泳分析，分子量为34．1KDa。5．研究了BY213菌株的内切葡聚糖酶酶学性质，其最适反应温度为65℃，最适pH值为3．5，在pH2．5~4．0仍表现出90％以上的酶活；55℃保温30min，酶活保持85％以上，但在pH2．5～8．5范围内稳定性较低，仅保留40％65％的原酶活性。关键词：内切葡聚糖酶I；DNA改组；酵母表达；酶学性质DNAshufflingofThermoascusaurandacusEndo-p—glucanaseIGeneandthestudyofEnzymicP

7、ropertiesAuthor：BAIYuSupervisor：GUORun—fangMajor：．MicrobiologyAbstractCelluloseisthemostabundantandwidelydistrbutedrenewablebiopolymersonearth．thetransformationofcellulosehasveryimportantsignificanceforthesolutionofenvironmentalpollutionandenergycrisisproblems．Cellulosecanbehydrolyze

8、dbyCellulase