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《嗜热脂肪芽孢杆菌高温蛋白酶的产生条件及酶学性质》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、40卷 2期2000年4月微生物学报ActaMicrobiologicaSinicaVol.40 No.2April 2000嗜热脂肪芽孢杆菌高温蛋白酶的产生条件及酶学性质31 彭珍荣2唐 兵 周林峰 陈向东 戴 玄(武汉大学生命科学学院 武汉 430072)摘 要:对嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilis)WF146的产蛋白酶的条件进行了
研究,在58℃条件下,WF146在pH值为715的Fd培养基中振荡发酵培养48h后,发酵液中高温蛋白酶产量可达600u/mL以上。对该酶性质的研究表明,酶分子量为34kD,最适作用
pH为810,最适
2、作用温度为80℃,具有良好的pH稳定性及热稳定性。Ca2+对该酶的稳定性具有重要影响,PMSF、DFP及IAA能强烈抑制酶活力,而DTT对该蛋白酶活力无影响。关键词:嗜热脂肪芽孢杆菌WF146,高温蛋白酶,性质中图分类号:Q936 文献标识码:A 文章编号:0001-6209(2000)02-0188-92蛋白酶是一类广泛应用于食品、医药、洗涤剂、纺织及皮革处理等方面的重要工业用酶。而高温蛋白酶具有耐热、耐变性剂、耐有机溶剂等优点,有重要应用价值。不仅如此,对高温蛋白酶的耐热机制的阐明还可以为人们利用蛋白质工程技术改造天然酶,从而提
高其稳定性提供理论依据。人们已经
3、从许多嗜热细菌中分离到高温蛋白酶[1～3],其中嗜热解朊芽孢杆菌(Bacillusthermoproteolyticus)生产的嗜热蛋白酶(thermolysin)已在工业
上用来生产二肽甜味剂(aspartame)[4]。但是,高温蛋白酶一般酶产量低、生产成本高。我们筛选到一株高温蛋白酶的高产菌株嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)
WF146[5],对其产酶条件及一些酶性质进行了研究。1 材料和方法1.1 菌株嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)WF146为本实验室分离鉴定[5]。1.2 Fd培养基(%)葡萄糖1,酵母
4、膏012,蛋白胨0105,NaCl012,CaCl2012,K2HPO40105,KH2PO4
010125,MgSO4·7H2O01001,FeSO4010001,pH718。1.3 细菌培养将嗜热脂肪芽孢杆菌WF146接种于装有40mLFd培养基的三角摇瓶(250mL)中,于58℃摇床(250r/min)培养48h后获得发酵液。1.4 酶的纯化将发酵液离心取上清液,在上清液中加入018%的SDS,于80℃保温5min后,进行硫
酸铵分级盐析(45%～65%饱和度),沉淀溶于缓冲液A(50mmol/LTris2HCl,5mmol/L
CaCl2,pH715)中,对相同
5、的缓冲液充分透析,然后过SephadexG50凝胶柱(2cm×75cm),3武汉市晨光计划资助项目(985003077)1现在工作地址:四川涪陵师范学院生物系;2通讯作者作者简介:唐 兵(1968-),男,山东省济南市人,武汉大学生命科学学院副教授,博士,主要从事微生物生理及应用微生物学研究收稿日期:1998205208,修回日期:1998210219©1994-2010ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://www.cnki.net 2期唐 兵等:嗜热脂肪芽孢杆菌高温
6、蛋白酶的产生条件及酶学性质189收集第一个蛋白峰,经SDS2PAGE检查为均一酶。
1.5 无Ca2+酶制备将酶液装入透析袋,在缓冲液B(50mmol/LTris2HCl,10mmol/LEGTA,pH715)中于
4℃透析过夜,再将透析袋放入缓冲液C(50mmol/LTris2HCl,pH715)中于4℃透析过夜,
获得无Ca2+酶。1.6 酶活力测定参见文献[5]。检测含有DTT的样品酶活力时,直接测定A280值。1.7 SDS2PAGE参见文献[6]。高温蛋白酶样品中加入10mmol/LIAA于25℃放置1h后,经热处理再进行电泳。蛋白质低分子量标准样品购自上海东
7、风丽珠生物制品公司。1.8 试剂苯甲基磺酰氟(PMSF)、二异丙基氟磷酸(DFP)购自Sigma公司,二硫苏糖醇(DTT)、
碘乙酸(IAA)、乙二醇2双(22氨乙基)四乙酸(EGTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)购自华美生物工程公司,其它化学试剂均采用国产或进口分析纯。2 结果2.1 产酶条件通过正交实验法,获得了嗜热脂肪芽孢杆菌WF146发酵产高温蛋白酶的Fd培养
基,WF146在Fd培养基中发酵产酶的最适温度为58℃(图12a),最适pH值为715(图12
b),增加通气量有利于产酶(图12c)。由图12d可见,WF146在Fd培养基
