产碱性蛋白酶的嗜热菌株筛选及发酵条件研究

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1、食品与发酵工业ＦＯＯＤＡＮＤＦＥＲＭＥＮＴＡＴＩＯＮＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ产碱性蛋白酶的嗜热菌株筛选及发酵条件研究杨冠东，杜少平，杨础华，黄琼（广州市微生物研究所，广东广州，５１０２５０）摘要在河南商丘盐碱地堆肥土壤样中分离到１株产碱性蛋白酶的嗜热菌株ＳＲ－１５，经鉴定为枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）。摇瓶发酵研究表明，其适宜培养条件为：玉米粉４０ｇ／Ｌ，黄豆粉４０ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４０５ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４１０ｇ／Ｌ，起始ｐＨ１００，培养温度４５℃，摇瓶转速１９０ｒ／ｍｉｎ，２５０ｍＬ三角瓶的装液量１

2、００ｍＬ，４８ｈ后发酵液酶活为１１８０Ｕ／ｍＬ。关键词碱性蛋白酶，枯草芽孢杆菌（ＢａｃｉｌｌｕｓＳｕｂｔｉｌｉｓ），发酵条件产碱性蛋白酶的微生物在自然界分布广泛。梅种子培养基：葡萄糖５，蛋白胨１０，酵母粉１０，［１］承芳等人从内蒙古的盐碱湖泊中筛选到１株产碱ＮａＣｌ１５，Ｋ２ＨＰＯ４１０，ＭｇＳＯ４０４，ｐＨ１００。［２］发酵基础培养基：葡萄糖１０，蛋白胨１０，牛肉膏性蛋白酶菌株，产酶活力为３５０Ｕ／ｍＬ，刘成圣等人从海洋弧菌（Ｖｉｂｒｉｏｐａｃｉｎｉ）Ｘ４Ｂ７分离纯化得到分１０，ＮａＣｌ１５，Ｋ２ＨＰＯ４１０，ＭｇＳＯ４０４，ｐ

3、Ｈ１００。子量为２７ｋｕ、等电点为８７的碱性蛋白酶。由于大１１４主要仪器多数从自然界分离的微生物所产碱性蛋白酶存在着ＳＷＣＪ１Ｆ型超净工作台（苏净集团），ＤＭＬＢ２酶活力低、耐热性差等缺陷，在工业化应用中受到限数码荧光显微镜（德国莱卡公司），７５２型紫外可见分制。光光度计（上海精密科学仪器公司），ＢｉｏｌｏｇＭｉ本研究从商丘地区的高温堆肥中分离得到１株ｃｒｏｓｔａｔｉｏｎ系统（Ｂｉｏｌｏｇ公司），２０Ｌ全自动发酵罐（上高产碱性蛋白酶的嗜热菌株ＳＲ１５，通过形态、生理海洋格生物工程设备有限公司）。生化特征、全自动菌种鉴定仪鉴定为

4、枯草芽孢杆菌１２方法（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ），并对其培养基组成、发酵条件进１２１菌株的筛选行了研究。将土样与无菌生理盐水混合后，取上清液涂布于分离培养基平板，于５５℃培养７２ｈ。生长的单菌落点１材料和方法种于酪蛋白培养基平板，于５５℃培养４８ｈ。将初筛获得的水解透明圈大的菌株接种到种子培养基中，５５℃１１材料摇瓶培养２０ｈ，然后再接种到发酵基础培养基，５５℃１１１土样摇瓶培养５０ｈ，测发酵液酶活。取自商丘地区高温堆肥的表层土壤。１２２碱性蛋白酶活性检测１１２试剂［３］采用紫外分光光度法，乘以换算系数Ｅ换算酵母粉

5、购自Ｏｘｏｉｄ公司，ＢＵＧ培养基、ＴＳＡ培为福林法酶活。酶活力单位的定义：１ｍＬ酶液在养基、ＧＮ／ＧＰＩＦ接种液购自Ｂｉｏｌｏｇ公司，酪蛋白为进口分装，其他试剂均为国产分析纯试剂。４０℃!ｐＨ１０５的条件下，每分钟水解酪素产生ｌμｇ酪氨酸所需的酶量为１个活力单位（Ｕ）。１１３培养基（ｇ／Ｌ）分离培养基：蛋白胨１０，葡萄糖５，琼脂５，ｐＨ１２３菌株鉴定１２３１生理生化特征鉴定６７。［４］按照《伯杰细菌鉴定手册》、《常见细菌系统鉴酪蛋白培养基：酪蛋白１５ｇ，Ｎａ，ＮａＣｌ２ＨＰＯ４２ｇ［５］定手册》有关章节进行初步鉴定。５ｇ，

6、琼脂１５ｇ，ｐＨ１００。［６］１２３２Ｂｉｏｌｏｇ全自动菌种鉴定仪鉴定斜面培养基：蛋白胨１０，酵母粉５，ＮａＣｌ１５，琼脂（１）平板纯培养：用木制接种棒挑取保存的待鉴１５，ｐＨ１００。定菌种，在ＢＵＧ＋Ｍ＋Ｔ琼脂平板上划十字接种，第一作者：硕士，高级工程师。３０℃培养１６～２４ｈ。收稿日期：２００８－０７－０２，改回日期：２００８－０８－０４（２）制备菌悬液：挑取培养好的菌落转移至无菌７０２００８犞狅犾３４犖狅１０（犜狅狋犪犾２５０）研究报告试管，移取３～５ｍＬＧＮ／ＧＰＩＦ接种液加至其中，制数，系统显示相似性（ＳＩＭ）为０

7、８，可能性（ＰＲＯＢ）为成乳白色悬浊液。在浊度计上调整菌悬液浊度在９９％，位距（ＤＩＳＴ）为０１２，最终鉴定结果是枯草芽２８％Ｔ±３％。孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）。（３）鉴定：用８道移液器取菌悬液加至９６孔鉴定２３发酵培养基的研究板的微孔，每个孔加１５０μＬ菌悬液，３０℃培养４～６２３１碳源对发酵产酶的影响ｈ，放入读数仪读取结果。以５种碳源（浓度为４％）作为唯一发酵碳源，发１２４摇瓶发酵酵产酶结果见表２。结果表明，以４％的玉米粉为发将试管斜面保存的菌种ＳＲ１５挑取１环，加入种酵碳源，产酶能力最佳，达到９９６Ｕ／ｍ

8、Ｌ。子培养基，４５℃培养２０ｈ，再按５％的接种量接种至发表２碳源对产酶的影响酵培养基，４５℃培养４８ｈ后，取样测定酶活。碳源（浓度４％）酶活／Ｕ·ｍＬ－１可溶性淀粉