嗜热子囊菌内切葡聚糖醋i基因的dna改组与酶学性质的研究

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1、摘要纤维素是地球上分布最广、蕴藏量最丰富的可再生资源。纤维素的利用与转化对于解决目前世界所面临的粮食短缺、环境污染以及能源危机等问题具有十分重要的意义。纤维素酶可以将纤维素水解成为葡萄糖，这是一条无污染且能有效利用纤维素的途径。但目前纤维素酶的成本仍较高，一些纤维素酶具有活性较低或热稳定性较差等缺点，通过定向进化可以不断提高并获得新性能的重组纤维素酶。本试验以嗜热子囊菌内切葡聚糖酶基因曙，为研究对象，通过DNA改组技术对野生型馏，进行突变重组，以期获得高内切葡聚糖酶活性、高稳定性的突变菌株。本研究主

2、要结果：1．通过优化DNaseI酶切时间、无引物PCR和有引物PCR的模板量等关键因素，建立适合于嗜热子囊菌内切葡聚糖酶基因改组的条件。2．以质粒pMD．18T-egI为模板进行PCR扩增，获得野生型曙，，利用DNAshuffling技术，得到大约400个突变克隆，随机挑选20株进行测序和序列分析，突变率达0．11％加．43％。3．将含有突变基因的重组质粒pMD．18T-egI和酵母表达质粒pPIC9K用SnaBI、NotI进行双酶切，经T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5a，抽提质粒，获得携带

3、不同片段的质粒。线性化后，采用LiCl转化方法转入毕赤酵母GSll5感受态细胞中，MD平板上筛选Mut+His+转化子。阳性转化子在基础盐培养基中诱导表达，经酶活测定，筛选出1株活性较高的菌株BY2，酶活为23．75U／mL，比出发菌株酶活提高了将近10倍。4．为得到高表达基因工程菌株，提取这株突变菌的基因组，以EG．S和EG-A为引物扩增该突变基因，序列分析发现该突变株为13号突变基因。突变基因与pPIC9K连接，线性化后进行电击转化。通过活性筛选，得到高活性突变体BY213，在基础盐培养基中培养

4、168h后，酶活可达到78．63U／ml，蛋白含量达到1．14mg／mL。表达产物经SDS．PAGE电泳分析，分子量为34．1KDa。5．研究了BY213菌株的内切葡聚糖酶酶学性质，其最适反应温度为65℃，最适pH值为3．5，在pH2．5~4．0仍表现出90％以上的酶活；55℃保温30min，酶活保持85％以上，但在pH2．5～8．5范围内稳定性较低，仅保留40％65％的原酶活性。关键词：内切葡聚糖酶I；DNA改组；酵母表达；酶学性质DNAshufflingofThermoascusaurandac

5、usEndo-p—glucanaseIGeneandthestudyofEnzymicPropertiesAuthor：BAIYuSupervisor：GUORun—fangMajor：．MicrobiologyAbstractCelluloseisthemostabundantandwidelydistrbutedrenewablebiopolymersonearth．thetransformationofcellulosehasveryimportantsignificanceforthesol

6、utionofenvironmentalpollutionandenergycrisisproblems．CellulosecanbehydrolyzedbyCellulasetoproduceglucose，anditisapollutionfreeandefficientuseofcelluloseapproach．Butcellulasehadsomedrawbackssuchashi．ghcost,lowactivityandthermalinstability．SOwewillimprov

7、eandobtainnewperformanceofeellulasebydirectedevolution．Inthisstudy,theThermoascusaurantiacusEndo-p-glucanaseIGeneWasmutatedtoobtainastrainwimlli曲CMCaseactivityandstabilityviashuffling．Themainresearchresultsarelistedbelow：1．111emethodisestablishedbyopti

8、mizingthetimeofDNaseIdigestionandthequantityoftemplateofprimerlessPCRandprimerPCR,whichadaptedtoshufflingofThermoascusaurantiacusEndo-p—glucanaseIGene．2．Thewide-typegeneofEndo—p-glucanaseI(eg，)wasamplifiedbyPCRfromplamidpMD18一T-egl。Abou