内切型-β-葡聚糖酶基因表达

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1、浙江大学硕士学位论文摘要摘要内切型．p．葡聚糖酶(CMC酶)是纤维素酶的重要组分之一，在纤维素水解糖化、食品、饲料、织物水洗等领域中应用广泛。本文采用基因工程技术，在内切型．p．葡聚糖酶基因重组菌株的构建、筛选及产酶等方面进行了研究。首先，以实验室前期克隆得到的厌氧真菌内切型．13．葡聚糖酶基因妒为研究对象，将目的基因与大肠杆菌表达载体pET-28a(+)连接，转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)／pET-28a(+)．aft。重组菌的适宜培养条件为：菌体浓度OD600为o．8时加入IPTG

2、至终浓度为O．1mM，310C诱导培养。采用SDS．PAGE蛋白电泳对其表达产物进行分析，在40kDa附近得到与目的基因卵表达蛋白理论值相当的明显条带。酶学性质研究表明，酶蛋白的最适作用条件为pH6．0，45。C，属于中性纤维素酶。试验结果证明妒基因具有适于表达的完整序列。进一步将印基因与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接，经限制性内切酶BgllI线性化后，采用基因导入仪将重组DNA转入毕赤酵母GSll5。在选择性培养平板上进行筛选，挑出六个高抗阳性转化子。提取基因组进行PCR鉴定，均获得与目的基因相关的条带，证明妒基因已整合入G

3、Sll5基因组，有利于稳定遗传。卵基因在甲醇诱导下可在毕赤酵母中表达，取上清液进行SDS．PAGE蛋白电泳分析，在52kDa附近出现明显条带。分别诱导培养筛选到的六个高抗阳性转化子，发现其产酶性能基本一致．采用重组毕赤酵母在摇瓶条件下分批发酵，结果显示其产酶性能稳定．在pH6．0，50。C条件下检测CMC酶活力，发酵液中酶活在诱导培养96h左右可达到600U／mL以上。该试验结果为进一步利用重组毕赤酵母生产中性纤维素酶奠定了基础。通过试管初筛、摇瓶复筛，从各约300个里氏木霉转化子T／aft(含有厌氧真菌内切型．p．葡聚糖酶基因

4、妒)和T／e911(含有里氏木霉内切型一D一葡聚糖酶基因eglI)中获得了T／aft．3和T／eglI-5两个优良转化子。对重组里氏木霉T／aft一3进行摇瓶产酶研究，在pn6．0，500C条件下测得发酵液中的中性CMC酶活力可达1280U／mL，提高到同期原始菌的3．9倍；而对重组里氏木霉T／eglI-5进行摇瓶产酶研究，在pH4．8，500C条件下测得发酵液中的酸性CMC酶活力可达到3500U／mL，约是同期原始菌的4．9倍。采用里氏木霉作为基因工程宿主茵具有II浙江大学硕士学位论文摘要外源基因表达水平高，产物易于分离提取等

5、优点，本文的研究成果在纤维素酶的定向进化及纤维素酶高产菌株的构建方面具有重要的指导意义。关键词：内切型．p．葡聚糖酶；基因重组；大肠杆菌；毕赤酵母；里氏木霉；基因表达；纤维素酶III浙江大学硕士学位论文AbstractEndo—p-glucanase(CMCase)isoneofthemostimportantpartsofcellulase，andhasgreatvalueincellulosedegrading,food，feedsmffproductionandfabricwashingfields．Thispaperfo

6、cllsedonconstruction,screeningandCMCaseproductionofhighendo-p-glucanaseproducingswainsbasedongeneengineeringtechnology．Anendo—B—glucanasegeneaf／fromanaerobicfungusWasinsertedintoEscherichiacoliexpressionvectorpET-28a(+)．ThentherecombinantplasmidpET-28a(+)一妒wastransfo

7、rmedintoEscherichiacoliBL21(DE3)toobtainrecombinantstrainBL21(DE3)／pET-29a㈩一afl．TheappropriateconditionstocultivaterecombinantEscherichiacoliwere：addedIPTGto0．1mMwhenthecellconcentrationreachedOD600=0．8，thencultivatedat31oC．SDS-PAGEanalysisofitsexpressionproductshowe

8、daclearproteinbandnear40kDa,whichaccordedwitllthatofAF1proteintheoreticsize．TheenzymeexhibitedmaximumCMCaseactivityatpH6．0，450C，whi