木霉内切葡聚糖苷酶EG分子定向进化的研究

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1、西南交通大学硕士学位论文木霉内切葡聚糖苷酶（EG）分子定向进化的研究姓名：易卓林申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：茆灿泉20080501西南交通大学硕士研究生学位论文第1I页再生能力强，与胞内表达的酶相比，避免了使酶释放破膜过程，减少酶分子的损失，催化效率更高。质粒的相关性质见图1．A8图1质粒pASKint100图谱FiglplasmidpASKintl00’Spicture附：(A)为外膜蛋白intimin的抽象简图：(B)为质粒pASKintl00的结构简图；外源片段两端酶切位点分别为SmaI和BamHI，质粒含氯霉素抗性基因和四环素抑制

2、子基因。目前用于生产纤维素酶的微生物大多为真菌，研究较多的有木霉属、曲霉属，和根霉属，其中丝状真菌木霉(Trichoderma．sp)是公认产纤维素酶最高的菌种之一吲。本研究采用的产内切葡聚糖苷酶菌为里氏木霉和康宁木霉。本研究利用生物信息学技术对欲改组的木霉内切葡聚糖苷酶序列进行了同源序列比对、进化树、分子二级结构和三级结构等分析，从另一个角度探索了内切葡聚糖苷酶的活性位点、结构域，对内切葡聚糖苷酶认识更深一步，进而寻找内切葡聚糖苷酶的可利用性。在此基础上，利用体外分子进化手段．DNA改组对内切葡聚糖苷酶从基因水平进行改造，通过产生大量的有益突变嵌合体和高效的筛选

3、手段获得理想的纤维素酶突变子，在酶活性和酶稳定性方面希望获得改进，同时借助于细菌展示系统，将酶分子展示在细菌表面，期望能有效提高微生物的纤维素降解能力。研究中主要采用方法：Clustalx等生物信息学软件对EG序列进行生物信息分析、经典DNA改组技术、交错延伸改组技术和RT—PCR法等。主要研究结果：两种木霉的EG酶催化降解纤维素时，关键氨基酸为两个G1u；一些芳香族氨基西南交通大学硕士研究生学位论文第1II页酸在与纤维素结合中起重要作用；一些氨基酸酰胺基[i：I在EG酶降解纤维素中起着重要的电子传递作用；两种木霉的EG酶都有特殊的三维催化域和结合域，有信号肽；所

4、制得木霉RNA的28S和18S条带清晰，其0D260／280在2．0附近，可用于下游操作；反转录获得T．r和T．k的PCR纯化产物，经测序鉴定为EG基因；质粒pASKintl00转化到大肠杆菌中，双酶切去磷酸化后得到约2ug产物；运用两种DNA改组技术对EG进行了改组，电泳图上在EG片段大小(约800bp)处有清晰条带；改组片段转化到大肠杆菌后，经质粒提取，然后Nael酶切鉴定，证实外源片段与质粒pASKint100的连接。最后经查阅资料和实验分析得出以下结论：生物信息分析技术对实验工作有指导和辅助作用；EG家族都有相类似的三维结构和催化机理；利用生物信息结果，设

5、计引物反转录所获的产物，经测序鉴定确为EG序列，证实生信分析理论和实验工作相结合的重要性；EG序列经两种DNA改组技术(经典改组和交错延伸改组)处理后，其序列重新被组装，证实DNA改组技术可改变片段一级结构；EG片段与原核展示系统pASKintl00连接后，展示于细菌表面，但未显示显著的生物活性，可能原核展示系统限制了EG展示酶的正确折叠。关键词：内切葡聚糖苷酶；DNA改组；展示系统；生物信息学西南交通大学硕士研究生学位论文第lV页AbstractCelluloseisthemostimportantcarbonresourseintheworld，account

6、ingforhalfoftheplantdrymass，whichisproducedbyphotosynthesis．Duetothelackofaneffectivemeanstodealwithcellulose，itsresourcesbecomeatremendouswaste．Throughthecomplexcellulasedigestion，cellulosecanbeeffectivelydegradatedandbecomesomeusefulproduce，suchasglucoseandethan01．Endoglucanaseisthe

7、importantcomponentsofthecellulasecomplex，whichcandegradatecelluloseintoeasyhandlingandsmallmoleculeofthenon—reductionendofcellulose，andoccupysanimportantpositionincellulose—energyproiects．Tofindeffectiveconversionofcelluloseways，toeffectivelyusealotofwasteofcelluloseresources，andtoeff

8、ectiv