枝孢霉脂肪酶的定向进化

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1、硕士学位论文枝孢霉脂肪酶的定向进化DirectedEvolutionofaLipasefromCladosporiumsp．作者姓名：菱壹田学科、专业：生物丝工学号：21118099完成日期：2014．6．6大连理工大学DalianUniversityofTechnology大连理工大学学位论文独创性声明作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请学位或其他用途使用

2、过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。学位论文题目：挝笪重躺匪盛堡叠鱼娅作者签名：盔扭日期：三!!生年jL月j一日大连理工大学硕士学位论文摘要脂肪酶在食品、油脂、洗涤剂和制药等工业中具有广泛应用。在洗涤剂中添加脂肪酶用来水解油脂污渍；在生物柴油的制备中可以作为催化剂。然而洗涤剂中的阴离子表面活性剂和制备生物柴油的底物甲醇都能分别影响脂肪酶的活性。本文采用定向进化方法来提高枝孢霉(Cladosporiumsp．)脂肪酶对甲醇

3、或阴离子表面活性剂的耐受性。本文用易错PCR法构建了枝孢霉脂肪酶的基因变体库，并通过毕赤酵母(Pichiapastoris)表达出突变脂肪酶。首先用罗丹明B平板初步筛选出阳性表达株，再用BMMY／三丁酸甘油酯双层平板法筛选出甲醇耐受性提高的突变脂肪酶，最后通过摇瓶发酵获得若干突变脂肪酶的酶液，对酶液进行甲醇耐受性检测和SDS耐受性检测，从中筛选出性质突出的脂肪酶突变体。第467号突变脂肪酶(简称#467)提高了甲醇耐受性，在三批甲醇浓度范围不同的实验中，#467在42．5％和45％的甲醇浓度下耐受性表现最为显

4、著，分别较野生型提高了39．8％和68．7％。突变的氨基酸是110位的异亮氨酸变为苏氨酸，355位的谷氨酸变为赖氨酸。第496号突变脂肪酶(简称#496)提高了对多种阴离子表面活性剂的耐受性，对SDS(十二烷基磺酸钠)的耐受性约为野生型的2．5倍，对AOS(a．烯基磺酸钠)耐受性约为野生型的2倍，对LAS(直链烷基苯磺酸盐)、AES(脂肪醇聚氧乙烯醚磺酸盐)耐受性约为野生型的1．5倍，突变的氨基酸是377位赖氨酸变为谷氨酸。随后对496的第377位氨基酸进行了饱和突变，替换为天冬氨酸的耐受性和496相当，而替

5、换为精氨酸或组氨酸则与野生型相当，表明该位点氨基酸侧链电荷性质对耐受性有较大影响。关键词：脂肪酶；定向进化；易错PCR；表面活性剂；酶的耐受性枝孢霉脂肪酶的定向进化DirectedEvolutionofaLipasefromCladosporiumsp．AbstractLipasescanbeusedinadiversearrayofareasincludingfoodindustry．oleochemicalindustry，detergentindustryandpharmaceuticalindustr

6、y．Lipasesareaddedindetergentstoremovegreasestains．andusedascatalystsinbiodieselproduction．Bothsurfactantsindetergentsandmethanolasasubstrateforbiodieselproduction．Caninhibitthelipaseactivity．Inthisstudy，directedevolutionofalipasefromCladosporiumsp．wascarrie

7、douttoimprovethetolerancetowardsmethanOloranionicsurfactants．ThemutantlibraryofCladosporiumsp．1ipasewasconstructedbyerror-pronePCRandmutantgeneswereexpressedinPichiapastoris．Firstly，positivecolonieswerecollectedinapre-screeningonRhodamineBplates．Thenlipases

8、wimhighertolerancetowardsmethanolwerescreenedonBMMY／glyceryltributyratedouble—layerplates．Finally，lipasesolutionswereobtainedthroughshakeflaskfermentationsandthetolerancetowardsmethanolorsurfactantswas