粉红螺旋聚孢霉(clonostachys

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5、作中发现分离自云南森林土壤的一株编号为YMF1.00611的粉红螺旋聚孢霉具有极高的杀线虫活性，24小时内能杀死90%的根结线虫（Meloidogynespp.）。本研究以粉红螺旋聚孢霉（YMF1.00611）为出发菌株，利用绿色荧光蛋白（GFP）对该菌进行分子标记，并对侵染过程进行定位追踪，初步阐明了粉红螺旋聚孢霉侵染线虫的动态过程。论文主要的研究结果如下：1．构建了适用于真菌表达的绿色荧光蛋白标记质粒，该质粒含有完整的绿色荧光蛋白表达元件和潮霉素抗性表达元件，可广泛应用于真菌的绿色荧光标记。2．

6、确定了粉红螺旋聚孢霉原生质体制备与转化的条件：0.3mol/LMgSO4,0.3mol/LNaCl缓冲溶液中含5mg/ml纤维素酶和5mg/ml蜗牛酶，180rpm，28℃反应过夜（约16个小时）进行原生质体制备；100μl(2.0×107-1.0×108个/ml)原生质体,10μg经HindIII线性化的质粒DNA，30UHindIII，150μlPTC进行转化，以蔗糖含量为0.6mol/L的PDAS为再生培养基进行再生，并利用600mg/ml的潮霉素抗性进行筛选，最终得到了稳定的转化子。3.应用

7、Southern杂交对4个转化子的整合模式进行了分析，结果显示均为多拷贝插入。该结果部分解释了转化子生长异常缓慢的原因。4．选择了1个转化子培养观察，清楚地观测到了粉红螺旋聚孢霉侵染线虫的整个过程：粉红螺旋聚孢霉的孢子团在较大湿度的环境中变为含有孢子的黏液团，线虫一旦进入黏液团中，变被牢牢黏住不得逃脱；当线虫筋疲力尽不动后，孢子大量黏附在线虫体表并开始萌发；萌发的菌丝在碱性蛋白酶和几丁质酶等水解酶的帮助下，穿破线虫体壁，在线虫体内大量繁殖；当线虫体腔充满菌丝后，一些菌丝重新长出到线虫体外，生成分生孢

8、子梗，并产生大量孢子，为下一轮的侵染做准备。整个侵染过程的观察与记录，为研究粉红螺旋聚孢霉等机会菌物侵染线虫提供了一个参考模型。本论文的创新性主要体现在以下的几个方面：1.构建了可广泛应用于真菌标记的绿色荧光蛋白质粒；并首次利用绿色荧光蛋白对粉红螺旋聚孢霉侵染线虫的过程进行了研究。2.首次发现了粉红螺旋聚孢霉的孢子团在侵染线虫过程中的重要作用，解释了该机会菌物是如何捕捉线虫的。关键词：粉红螺旋聚孢霉；绿色荧光蛋白（GFP）；原生质体转化；侵染机制；线虫ABSTRACT