粉红螺旋聚孢霉67-1菌寄生相关基因的筛选与功能研究

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1、密级：论文编号:中囯农亚科学院学位论文粉红螺旋聚孢霉67-1菌寄生相关基因的筛选与功能研究ScreeningandFunctionalAnalysisofMycoparasitism-RelatedGenesinClonostachysrosea67-1博士研宄生：孙占斌指导教师：李世东研宄员申请学位类别：农学博士专业：植物病理学研宄方向：植物病害防治培养单位：植物保护研究所研宂生院2015年5月密级:论文编号:中国农业科学院学位论文粉红螺旋聚孢霉67-1菌寄生相关基因的筛选与功能研究ScreeningandFunctionalAnalysisofMycoparasit

2、ism-RelatedGenesinClonostachysrosea67-1博士研究生：孙占斌指导教师：李世东研究员申请学位类别：农学博士专业：植物病理学研究方向：植物病害防治培养单位：植物保护研究所研究生院2015年5月Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationScreeningandFunctionalAnalysisofMycoparasitism-RelatedGenesinClonostachysrosea67-1Ph.D.Candidate：SunZhan-binSuperviso

3、r：Prof.LiShi-dongMajor：PhytopathologySpecialty:ManagementofplantdiseasesMay2015III摘要粉红螺旋聚孢霉（Clonostachysrosea，又名粉红粘帚霉Gliocladiumroseum）是一类重要的菌寄生真菌，可以防治核盘菌、灰葡萄孢、镰刀菌、立枯丝核菌等引起的多种植物真菌病害，同时还可以促进作物生长，在温室和田间试验中广泛应用，具有巨大的生防潜力。但目前尚未见该菌寄生核盘菌菌核分子机制的报道。为阐明粉红螺旋聚孢霉寄生菌核机制，筛选菌寄生相关基因，本研究以实验室前期分离得到的一株高效粉红

4、螺旋聚孢霉菌株67-1为材料，通过高通量测序技术分别获得了67-1全基因组序列和寄生核盘菌菌核转录组信息，并研究了其脂滴包被蛋白基因per3、几丁质酶基因chi67和单加氧酶基因mono67在寄生菌核过程中的作用。本研究以67-1菌丝为材料，提取基因组DNA后进行全基因组测序和分析。首先构建了三个PE文库（170bp，300bp和500bp）和1个MP文库（5kb），采用IlluminaHiseq2500平台进行测序，测序覆盖度大于150×，对序列进行组装后共得到1,552个contigs（重叠群），N50为99,664bp。这些contigs继续组装形成475个sca

5、ffolds，N50为569,489bp。最终组装信息表明，67-1基因组大小为55.4Mb，G+C含量为49.2%。通过Fgenesh软件分析，共预测出20,747个基因，与NCBINR数据库比对，共有13,474个找到同源序列。67-1基因组序列信息为后续研究其与植物病原真菌的互作提供分子基础。为研究粉红螺旋聚孢霉67-1寄生核盘菌菌核分子机制并筛选寄生相关基因，本研究利用高通量测序和实时荧光定量PCR技术筛选获得了67-1寄生核盘菌菌核不同时间间隔（8h、24h和48h）的差异表达基因。转录组测序和分析表明共得到26,351个单值基因，其中有18,525个基因可以

6、注释到NR、KEGG、Swiss-Prot、GO和COG数据库。在3个寄生时间段分别有3,217、4,025和4,274个基因上调表达，2,739、1,249和1,064个基因下调表达。对差异表达基因进行实时荧光定量PCR检测，发现菌核诱导下12个基因明显上调表达，与转录组分析一致，为研究粉红螺旋聚孢霉寄生相关基因提供候选基因。内参基因是应用实时荧光定量PCR精确检测基因表达量的基础。为了筛选67-1寄生菌核过程中稳定表达的内参基因，本研究选择了7个真菌常用的管家基因，18S核糖体蛋白基因(18SrRNA)肌动蛋白基因（Actin），β-微管蛋白基因（β-tubulin

7、），延伸因子基因（Elongationfactor），泛素基因（Ubiquitin），泛素结合蛋白基因（Ubiquitin-conjugatingenzyme）和甘油3-磷酸脱氢酶基因（Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase），通过geNorm、Bestkeeper和Normfinder三个常用内参基因表达稳定性分析软件进行分析，发现延伸因子基因表达在不同阶段均最为稳定，可以用于67-1寄生核盘菌菌核相关基因的定量。本文通过67-1寄生菌核转录组数据分析，得到一个编码脂滴包被蛋白的基因per3、一个