盾壳霉产孢相关基因cm1107的功能研究

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1、华中农业大学硕士学位论文盾壳霉产孢相关基因Cm1107的功能研究姓名：陈雪申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：姜道宏201206华中农业大学2012届硕士毕业论文摘要盾壳霉(Coniothyriumminitans)是植物病原真菌核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)的重寄生真菌。在前期，实验室构建了盾壳霉ZS．1菌株的T-DNA标记插入突变体库(含30500个突变体)，其中ZS．1T2029是产孢缺陷型突变体。通过抑制性差减杂交(SSH)的方法，获得一些在盾壳霉产孢时期表达上调的表达序列标签(EST)。本文在实验室前期研究基础上，通过反向遗

2、传学的方法，对其中一个表达上调的基因Cmll07进行了初步研究，研究结果如下：通过生物信息学分析发现Cmll07基因为单拷贝，全长1395bp，具有2个外显子，1个内含子(64bp)。Blastx分析发现该基因与碱性螺旋．环．螺旋(basicHelix．100p．helix，bHLH)转录因子相似性最高，该基因产物3’-端含有螺旋-环-螺旋(HLH)结构域(cd00083)。转录因子bHLH超家族包含大量参与发育相关过程的一系列蛋白，这些蛋白都拥有一段碱性区域(basicregion)和HLH结构域。在其他真菌中，已经有一些研究证明bHLH转录因子与真菌有性和无性孢子

3、的发育相关。RT-PCR结果表明Cmll07基因在盾壳霉生长发育的各阶段均表达，且在孢子萌发阶段的表达量最高。根据同源重组原理构建了基因敲除载体，通过采用农杆菌介导转化(朋MT)盾壳霉孢子的方法，获得了3个Cmll07基因的敲除转化子(K01107)。在PDA上培养时，K01107与野生菌株ZS．1相比在生长速度、菌丝形态等方面均无显著变化。但K01107中许多孢了的形态较大，这种异常的孢子所占比例超过16％，而ZS-l巾异常孢子的比例小于2％。K01107在菌落表面产生的孢子与ZS．1相比显著降低，但在菌丝块内部产生的孢子与ZS一1无显著差异。与核盘菌菌株1980对

4、峙培养时，ZS．1的孢子能跨越菌丝接触区在核盘菌菌丝上形成黑色的分生孢子器，而KOll07在菌丝交界处无法产孢。在寄生核盘菌Ep．1PNA367菌核时，ZS．1在菌核表面形成大量分生孢子器，而K01107只能产生少量的分生孢子器。此外，KOll07寄生菌核能力与ZS．1相比显著下降。同时我们成功构建了Cmll07基因的超表达载体，并获得了超表达转化子(OEll07)，后续研究仍在进行中。研究结果初步表明Cmll07基因对盾壳霉产孢有一定的调控作用，这将有助于我们进一步阐明盾壳霉产孢相关的信号途经。关键词：盾壳霉；重寄生真菌；核盘菌；碱性螺旋．环一螺旋；转录因子ABST

5、RACTConiothyriumminitansisanimportantbiocontrolagentofrapeseedstemrotcausedby＆尼rotiniasclerotiorum，whichiSdistributedworldwide．AT-DNAinsertionaIlibrary谢th30500mutants，ofwhichZS-1T2029iSamutantdeficientinconidiation．wasconstructedinourlab．SomeESTswhoseexpressionswereupregulatedwasditecte

6、dthroughsuppressionsubtractivehybridization(SSH)．Inthisresearch,Cmll07,relatedwithconidiationofCminitans，waspreliminarilystudiedthroughreversedgeneticmethodsonthebasisofpriorresearch．Theresultswereasfollowed：ByanalyzingthegenomesequenceofCminitans晰t11bioinformaticmethods，itrevealedC珑JJD

7、7gene，a1395bpfragment丽mtwoexonsandoneintron(64bp)，hadasinglecopyinthegenome．SequenceanalysisthroughblastxshowedCmll07hadhighidentitywithbasicHelix-loop—helix(bHLH)transcriptionfactor,what。Smore，3’endofCmll07containedHelix—loop-helix(HLH)domain(cd00083)．ThebHLHtranscriptionfacto