盾壳霉小rna相关通路基因的功能研究

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1、华中农业大学硕士学位论文盾壳霉小RNA相关通路基因的功能研究姓名：曾丽斯申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：付艳苹；程家森201206华中农业大学2012届硕士毕业论文摘要盾壳霉(Coniothyriumminitans)是植物病原菌核盘茵(Scleroiniasclerotiorum)的重寄生真菌。小RNA调控通路广泛存在于高等和低等生物体内，其中Dicer酶在小RNA的加工过程中起重要的剪切作用，AGO蛋白则是小RNA行使功能的RNA诱导沉默复合体(RNAinducedsilencingcomplex，PdSC)中的重要成员。这些基因在动植

2、物以及部分真菌中的功能已有研究报道，但在盾壳霉中这些基因的功能尚不明确，本文对盾壳霉的AGO、DCLl及DCL2基因的功能进行了相关研究。首先我们通过RT-PCR证实了CmAGO、C，加IC己J『和CmDCL2在盾壳霉的生长和产孢等阶段均有表达。根据同源重组的原理构建了这三个基因的敲除载体，通过农杆菌介导转化盾壳霉分生孢子，经PCR和Southern杂交验证分别得到了3个CmAGO敲除转化子，4个CmDCLl敲除转化子和8个CmDCL2敲除转化子。构建了相关基因的互补载体，并得到了3个CmDCL2基因的互补转化子。进一步研究表明，在PDA培养基上，Cm

3、AGO、CmDCLl和CmDCL2敲除转化子的菌落、菌丝及孢子形态与出发菌株zS。1相比均无显著差异，但生长速度、寄生致腐核盘菌菌核能力均显著低于出发菌株ZS．1；产孢量、产抗真菌物质能力均显著高于出发菌株ZS．1：CmAGO敲除转化子孢子萌发速率显著高于出发菌株ZS-1：核盘菌Ep．1PNA367与三个基因敲除转化子对峙培养时，两菌菌丝融合会促进敲除转化子在交界处产孢增加：CmAGO和CmDCL2敲除转化子与带病毒的灰霉菌Bcl0HN454菌株对峙培养可获得病毒，CmAGO和CmDCL2敲除转化子感染BcHV／10HN454和BcTV／10HN454

4、病毒后，表型发生显著变化，CmDCL2敲除转化子产孢量明显减少，CmAGO敲除转化子不产孢。CmDCL2互补转化子在生物学性状各方面测定中均与出发菌株ZS．1无显著差异。上述研究结果表明CmAGO、CmDCL，和CmDCL2基因在盾壳霉的生长发育和寄生核盘菌等方面发挥重要作用。关键词：盾壳霉；小RNA；AGO；DCLl；DCL2华中农业大学2012届硕士毕业论文ABSTRACTConiothyriumminitansisanimportantbiocontrolagentofplantpathogensSclerotiniasclerotiorum．S

5、mall刚qAiswidespreadfromprokaryotestoeukaryotes．TheDicerplaysallimportantroleinthesplicingofhairpin-likeRNAanddouble—strandedI斟A，whiletheArgonauteproteinsareessentialcomponentsofthemicroRNA·inducedsilencingcomplex(RISe)，andbothofthemplayimportantrolesinmicroRNAbiogenesis．Thefunct

6、ionofAGOJDCLlandDC￡2havebeenwellstudiedinanimals，plantsandsomefilamentousfungus．whiletherolesofAGnDCLlandDCL2inCm加itansarestillnotclear．Herein,thefunctionofAGD．DCLlandDCL2werestudiedinC掰加itans．Firstly,thetranscriptionofCmAGo．CmDCLlandCmDCL2weredetectedhImPC&andtheresultsshowedth

7、atthesegenesexpressconstructivelyinCminitans．Strdmscontainingnull-mutationsofCmAGD．CmDCLlandCmDCL2wereconstructedbyhomologousrecombination．Geneknock-outvectorsweretransformedintoconidiaofCmmitanswithAgrobactiriumtumfaciens-mediatedtransformation．ThreereplacementmutantsofCmAGO,fo

8、urreplacementmutantsofcmDCLlandeightreplacement