盾壳霉耐碱缺陷型突变体的筛选及相关基因克隆的初步研究

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1、内蒙古农业大学硕士学位论文盾壳霉耐碱缺陷型突变体的筛选及相关基因克隆的初步研究姓名：张禄申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：刘正坪;姜道宏20060501摘要盾壳霉(Coniothyriumminitans)是引起作物菌核病的核盘菌(Sclerotiniasclerotirium)的重要寄生真菌，在世界范围内广泛存在，是菌核病的一种重要生防茵。盾壳霉可以在pH2—12的环境下生长，说明本身具有耐碱的特征。本论文主要目的在于获得耐碱缺陷型盾壳霉，从中克隆耐碱相关的基因，为培育耐碱作物积累基因材料。实验自实验室前期构建好的盾壳

2、霉T-DNA插入突变体库筛选获得了4个耐碱缺陷型突变体，并对它们的生物学特性进行了研究。在筛选出的突变体基础上，利用Tail-PCR技术扩增目的片段，同时对所获得的目的片段进行了克隆和鉴定。实验共从4300个插入转化子中筛选到ZS-1T2613、ZS一1T2979、ZS—IT3446和ZS-1T20266四个突变体，插入突变的频率约9．3×10q。他们在pH为9．0的PDA培养基匕不能生长，其中突变体ZS-IT3446在pH为8．0的PDA培养基上就已不能生长。4个突变体与ZS-1菌株相比较，生长速度和产抗生素能力差异显著。而在产

3、孢能力方面，除了突变体ZS-1T2979不产孢、菌落为白色外，其他3个突变体和ZS-I无明显差别。说明该突变体T-DNA插入到了一个表型控制的功能基因。通过对4个突变体的Tail-PCR扩增和电泳检测，结果显示只有突变体ZS-IT2979的L端和随机引物扩增出目的片段，且第二次扩增与第三次扩增的片段正好相差约150bp(既L2与L3的差距)，说明此片段可能是耐碱功能相关基因。关键词：盾壳霉，耐碱相关基因，突变体，T_DNA插入诱变ScreeningofAlkali-tolerancedeficientmutantsfromaT-D

4、NAinsertionallibraryofConiothyriumminitansandcloningofalkali—associatedgenesAbstractConiothyriumminitans,animportantsclerotialmycoparasiteofSclerotiniasclerotiorumwithworldwidedistribution，hasgreatpotentialforbiologicalcontrolofplantdiseasescausedbySsclerotiorumandoth

5、erSclerotiniaspp．C．minitansZS一1couldgrowthunderpH_2topH12，whichindicatesthatZS-1hasalkali-toleranceassociatedgenes．Ourworkistoscreenalkali-tolerancedeftcientmutantsfromaT．DNAinsertionallibraryofeminitansandclonealkali-associatedgenesandaccumulategenematerialforalkali-

6、tolerancecrop．Fouralkali—tolerancedeficientmutantswereobtainedfromtheinsertionallibraryofstrainZS．IconstructedagoandtheirbiologicalcharacteristicswerestudiedTheDNAfragmentsflankedtheT-DNAinthese4mutantswereamplifiedbyTail-PCR,andonefragmentwasclonedandidentifidedInthi

7、sstudy，4mutants，ZS一1T2613、ZS一1T2979、ZS一1T3446andZS一1T20266，werescreenedfrom4300insertionalmutants，andthefrequencyofinsertionalmutationis9．3×104；ZS一1T3446couldnotgrowatapHvalueof8．0，theotherthreecouldgrowmuchsloweratpH8．0，butstopgrowingatpH9．0．ComparingwithZS一1，fourmut

8、antsshowsignificantdifferenceinthegrowthrateandproductionofanfibactefiflsubstanoe．ZS-1T2979failedtosporulateonbothnormalanda