mapk途径在盾壳霉产孢子及重寄生作用中的功能研究

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1、华中农业大学博士学位论文MAPK途径在盾壳霉产孢子及重寄生作用中的功能研究姓名：曾丹云申请学位级别：博士专业：植物病理学指导教师：姜道宏201206MAPK途径在盾壳霉产孢和重寄生作用中的功能研究摘要核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum(Lib．)deBary)是一种世界性分布的病原真菌，能导致多种重要作物的病害。盾壳霉(Coniothyriumminitans)是防治菌核病的一种重要生防菌。盾壳霉分生孢子的形成对其完成自身的生活史及重寄生作用非常重要。关于盾壳霉的产孢机理已有一些

2、报道，但盾壳霉产孢是一个非常复杂的过程，分生孢子形成的调控网络目前尚不清晰。本论文主要以自盾壳霉T．DNA插入体库中筛选到的一株产孢缺陷型突变体ZS一1T1000为研究对象，通过TAIL．PCR等技术获得了T-DNA的侧翼序列，并以此展开研究了盾壳霉中与细胞壁完整性相关的MAPK途径(CWI．MAPK)在盾壳霉重寄生、产孢及其维系自身细胞壁稳定过程中的作用。同时也研究了与酵母中的另一MAPK途径，FUS3／KSSlMAPK途径中STE7的同源物CmSTE7在盾壳霉寄生核盘菌菌核中的作用，主要研究结果

3、如下：1)突变体ZS．1T1000丧失产孢能力系由T—DNA单拷贝插入破坏所致，T．DNA插入破坏了一个编码蛋白激酶激酶激酶的CmBCKl基因。CmBCKl基因的3’临近末端处含有一个内含子，基因编码区序列(CDS，codingsequence)为5361bp，编码大小为1786aa的蛋白质。T—DNA插入在该基因的5100bp位点，破坏了该蛋白质的蛋白激酶催化保守结构域。CmBCKI基因在盾壳霉基因组中为单拷贝基因，T-DNA的插入导致CmBCKl功能缺失，致使ZS一1T1000不能形成分生孢子器

4、及分生孢子，寄生菌核能力显著下降，对细胞壁合成抑制剂及细胞壁降解酶敏感，菌落中央气生菌丝发生自溶，产色素能力显著下降。2)CmBCKl基因敲除转化子丧失产孢能力，中央的气生菌丝出现自溶现象，产色素能力显著下降，对细胞壁合成抑制剂及细胞壁降解酶敏感，在寄生菌核能力方面存在缺陷，寄生能力显著下降，其表型与突变体ZS．1T1000类似。3)根据序列同源性，自盾壳霉中克隆了酵母CWI．MAPK途径中BCKl下游Sit2的同源基因CmSlt2。CmSlt2基因含有5个内含子，CDS为1254bp，编码大小为4

5、17aa的蛋白质。与CmBCKl突变体类似，CmSlt2基因的敲除转化子也丧失了产孢能力，寄生核盘菌菌核能力显著下降，增加对细胞壁合成抑制剂及细胞壁降解酶的敏感性，影响色素的形成，菌落中央菌丝自溶。CmSlt2突变体的缺陷表型可被自身的CmSlt2基因互补所恢复。∞结合CmBCKI及CmSlt2在盾壳霉中功能，表明CWI—MAPK途径参与调控盾壳霉的产孢、重寄生作用、色素形成及维持细胞壁稳定。1华中农业大学2012届博士研究生学位论文5)从盾壳霉中克隆了与酵母FUS3／KSSlMAPK途径中STE7

6、同源的CmSTE7。CmSTE7基因含有3个内含子，CDS为1362bp，编码大小为453aa的蛋白质。CmSTE7突变体菌落白色，不产生色素(后期在培养基基质中产生微量的色素)，不能形成分生孢子器，气生菌丝增多，菌丝顶端分支增多，对核盘菌菌核的重寄生能力显著下降。结果表明CmSTE7参与调控盾壳霉的分生孢子器形成、重寄生作用及色素的产生。综上所述，MAPK信号途径中的CWI．MAPK途径及FUS3／KSS1MAPK途径在盾壳霉产孢及重寄生过程中起着至关重要的作用，研究结果为阐明盾壳霉产孢及重寄生的

7、作用机制提供了理论基础，丰富了丝状真菌的发育和致病相关的分子生物学内容，同时也为高效地规模化生产盾壳霉分生孢子提供了理论依据。关键词：盾壳霉；促分裂原活化蛋白激酶级联反应；细胞壁完整性；分生孢子形成；分生孢子：重寄生作用；生物防治；核盘菌2MAPK途径在盾壳霉产孢和重寄生作用中的功能研究ABSTRACTSderotiniasclerotiorum(Lib．)deBaryisaworldwidefungalpathogencausingseriousdiseasesonmanyeconomically

8、importantcrops．ConiothyriumminitansisanimportantbiocontrolagentagainstSclerotiniadiseases．TheconidiationofCminitansisveryimportanttoitslifecycleandmycoparasitism．PreviousworkhadreportedabouttheconidiationofCminitans，however，thecomplexne