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1、细胞培养基本技术概述无菌操作基本技术1.实验进彳亍前，无菌室及无菌操作台(laminarflow)以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70%ethanol擦拭无菌操作抬而，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共亨培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物晶带出工作台，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。2.无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物甜，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流Z流通。
2、实验用品以70%ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之屮央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。3.小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45。角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌而。4・工作人员应注意口身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来口人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适出等级之无菌操作台(至少ClassII)o操作过程屮，应避免引起aerosol之产牛，小心毒性药品，例如DMS0及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。5.定期检测下列
3、项5.1.C02钢瓶之C02压力5・2・C02培养箱之C02浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。5・3・无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网(300小时/预滤网,3000小时/IIEPA)o6.水槽可添加消毒剂(Zephrin1:750),定期更换水槽的水。实验用品1.种类：1.1.细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteurpipet夕卜，其它均为報料无菌制品O1.2.TC级培养盘表而均有coating高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask,plates,dishes,rollerbottle等
4、，依实验需要使用。1.3・plasticsterilepipet:1ml,2ml,5ml,10ml,25ml1..4.塑料离心管：15ml,50ml,均有2种不同材质，其polypropylene(PP)为不透明材质，polystyrene(PS)为透明材质，AT依实验需要而选择适合材质之离心管。3.5.glasspastuerpipet:9inch,用以抽掉废弃培养液等。1..6.玻璃血清瓶(PyrexorDuranglassware):100ml,250ml,500ml,1000ml2..清洗：2.新购玻璃血清瓶先以0.P0.05NHC1浸泡数小吋，洗净后才开始使用。4.2.用
5、过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一•次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。5.灭菌：5.实验用玻璃血清瓶以铝箔纸色覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121oC,15lb,20分钟，置于oven中烘干。1..2.实验用玻璃pasteurpipet以干热灭菌170oC,4小吋。1..3.液体或是固体废弃物可用10%hypochloride溶液(次氯酸，即漂白水)或是蒸汽高压灭菌121oC,15lb,20分钟处理。培养基1.液体培养基贮存于4oC冰箱，避免光照，实验进行前放在37oC水槽屮温热。2.液体培养基(加血清)存放期为六个月，期间glutamine可能会分解，若细胞牛长不佳,可
6、以再添加适量glutamine。3.粉末培养基配制(以1升为例)：3.细胞培养基通常须添加10%血清，因此粉末培养基Z配制体积为900ml,pH为7.2-7.4。NaHC03为另外添加，若将NaHC03粉末直接加入液体培养基中会造成pH之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHC03粉末应分别溶解后才混合，然后用C02气体调整pH,而非用强酸(HC1)或强碱(NaOH),因为氯离子对细胞牛长可能有影响，且贮存时培养基的pH易发牛改变。3.2.材料：3・2・1・纯水(milli-Q水或二次至三次蒸馆水,水品质非常重要)3・2・2・粉末培养基1...2.3.NaHC03(SigmaS-
7、4019)3.2.4.电磁搅拌器3.2.5.无菌血清瓶1.4.2.6.0.1或0.2mm尢菌过滤膜3.2.7.pHmeter3.2.8.真空帮浦3.2.9.C02气体3.3.步骤：3・3・1・取粉末培养基溶于700mlmilli-Q水中,搅拌使其溶解。3・3・2・称取适量之NaHC03粉末(数量依培养基种类而异，表一)溶于200mlmilli-Q水屮，搅拌使其溶解，然后通入C02气体至饱和，约3-5分钟。1.3.3.将溶解J1含饱和C02之NaIIC03溶液加入溶解之
