脂肪干细胞培养(精品).doc

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1、干细胞论坛脂肪干细胞培养吸脂术时用无菌针管从臀上方吸取深层脂肪组织20mL.在1h内将其移至离心管内，加入等量PBS缓冲液，充分振荡后低速离心800r/minX10min.反复冲洗3次后加入等量15g/LI型胶原酶.37°C水浴中充分振荡30min,再加入等量胎牛血清（FBS）屮止.低速离心10min后弃去上清.将下层细胞用PBS悬浮后加入16mmol/LNH4C137°C水浴中10min以裂解红细胞.低速离心10min后再用PBS冲洗3次.最后将细胞用含100mL/LFBS+10g/L青霉素的DMEM悬浮后移

2、入培养瓶中,37°C,50mL/LC02培养箱中孵育,48h后首次换液,弃去悬浮细胞.随后每3d换液，1wk后传代.将第3代细胞用于流式细胞仪检测.浓集细胞到109/L后进行流式细胞仪检测.细胞传至第3代吋将其以2X107/L的细胞数分别转入各定向培养基屮进行培养.诱导培养2wk后，对成脂诱导组进行油红0脂肪颗粒染色，另外：现在脂肪干细胞缺乏特异的表面标志鉴定，各类文献提到脂肪干细胞表达阳性的标志物有：cdl3,cd29,cd59,cd49e,cd73,cd90,HLA-ABC等。但表达阳性不代表具有特异性，所

3、以要从标志物上鉴定脂肪干细胞还是很困难的，应该说不具有很强的说服能力。按文献所说的步骤来提取脂肪干细胞，形态类似T细胞，并且具有多向分化的能力，这就足以说明提取的细胞是干细胞。你要是想证明你养的就是干细胞，最好的办法我认为还是做个多向诱导分化。干细胞传代吸出来以后，常速离心，用pbs洗两遍后，accutase管内消化5-10min,加入基础培养基离心洗去消化液，分瓶传代。人脂肪干细胞的分离、体外培养及鉴定［摘要］目的：进行人脂肪干细胞的分离、体外培养及鉴定，为组织工稈的进一步研究提供实验依据。方法：将剪碎的人脂

4、肪组织加入I型胶原酶消化，离心。将细胞悬液置于6孔培养板屮，37°C、5%CO2培养箱中培养，细胞达80%融合时进行传代。选取第3代细胞，进行免疫组织化学染色，检测细胞表面抗原标记物;选取第3代细胞，分为成骨诱导组和成脂诱导组，每组乂分为诱导组（加入相应诱导培养基）及对照组（未经诱导的细胞）。成骨诱导72h示进行碱性磷酸酶（AKP）含暈检测,8d麻进行茜素红染色，检验细胞内是否出现钙沉积；成脂诱导2周后进行油红O染色，检测细胞内是否形成脂滴。结果：培养细胞均有CD44、CD49d抗原阳性表达，不表达CD45、C

5、D106抗原；成骨诱导72h后，诱导纟R细胞内AKP含量（014883U・g・4prot）校对照组（010632U・g・1p「ot）明显增高（P<0105）;8d示诱导纟fl茜素红染色阳性，对照纟H.阴性；成脂诱导2周示汕红0脂肪颗粒染色为阳性，对照组为阴性。结论：利用原代细胞培养技术可成功地从人脂肪组织屮分离出脂肪干细胞。［关键词］干细胞；细胞分离；细胞培养组织缺损是報形外科常见的疾病，包括骨、软骨、脂肪等多种组织的缺损。白体组织移植是目前最常用的方法，但其主要问题包括容易坏死和吸收、组织量有限、供区瘢痕等，

6、因此往往无法达到预期治疗效果。组织工程是人体组织修复的理想方法，其中种了细胞的选择非常重要。目前，可被选用作为纟H•织工程种了细胞的主要为各种类型的干细胞，而成体干细胞屮的脂肪干细®1（adipose2derivedstemcells,ASCs）具备来源T•富、可反复取材、痛苦小、易扩增、能安全植入同体或异体等优点，且无道徳争议，具有比骨髓干细胞更多的优点。因此ASCs是组织工程优秀的种了细胞。日前，国内研究者对于ASCs的研究开展较晩，且尚无系统丿'V川于临床的报道。木研究通过原代细胞培养技术，对人ASCs进

7、行分离、体外培养及鉴定，为今后组织工程的深入研究打下基础。1材料与方法★实验材料皮下脂肪组织20mL，取白-•名35岁健康女性，由吉林大学第-•医院整形外科手术切取。★试剂及仪器高糖DMEM培养基（Gibco）,标准胎牛血清（广州赛业），胰蛋白酶、I型胶原酶、地塞米松、胰岛素、维生素C、32异丙基212甲基2黄嚓吟（IBMX）、汕红0染色剂、苏木精染色剂（Sigma）,{522磷酸甘油（Amresco）,眄陈美卡（临汾奇林药业），碱性磷酸酶（AKP）检测试剂盒（南京建成生物）,CD44、CD45、CD49、CD

8、106多克隆抗体及辣根酶标记羊抗兔IgG（北京博奥特生物），增强型HRP2DAB底物显色试剂盒（Tiangen）,青-霉素钠、链霉素。★细胞分离培养及传代于术切取脂肪纟H•织2h内将脂肪组织送至实验室，在超净台屮将脂肪组织衣D2Hankfs液屮漂洗3次，尽量去除结缔组织及血管内皮，将其剪成1mmximmximm的纟fl织块。将剪碎的组织置于高糖DMEM培养基屮，加入01075%的I型胶