人来源脂肪干细胞的培养

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1、人来源脂肪干细胞的培养1．脂肪干细胞原代培养1)取约500mg脂肪组织（自外科手术患者的皮下获取），再将脂肪组织一次挤压进入准备好的15ml离心管中，每个离心管中的组织不超过5ml。2)吸取缓冲液PBS7ml加入到上述装有组织的离心管中，用吸管吹打10~20次，然后静置1min左右，用吸管将组织下层的液体吸出。如此反复直到所吸出的液体呈透明状，不带有血细胞为止；3)向有脂肪组织的试管中加入与组织量相同大约5ml左右的消化液（胰酶0.25%，I型胶原酶0.1%，以1：1比例混合配制而成），将试管密封，放入37°C恒温摇床中，190r/min

2、，震荡消化30min。此时液面分为3层，上层为黄色油状脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含单个核细胞的液体；4)吸出离心管中的下层液体移入含完全培养基（含10%胎牛血清的高糖DMEM）的新离心管中终止消化，然后将离心管封闭，1500rpm离心10min；5)用吸管吸取上清后去掉，加入1ml培养基，轻轻吹打10~20次制成细胞悬液，将各个离心管中的细胞悬液收集起来，接种待用；6)在剩余脂肪中加入新的胰酶和胶原酶，重复以上步骤继续消化，重复2-3次，将收集到的有核细胞按照一定的密度接种到培养瓶中，放入37°C、5%CO2培养箱培养；7)第一

3、次换液：大约12-24小时后，观察细胞贴壁即可进行第一次换液，此后每隔3天换液，待细胞生长至融合后进行传代。2.脂肪干细胞传代培养1)在超净工作台内吸去培养瓶内的旧培养基，加PBS冲洗2-3次，之后加入1-2mL消化液（0.25%胰酶和0.04%EDTA(v/v1:1)）；2)培养箱内进行消化（3-5min），倒置显微镜下观察贴壁细胞形态变化，当贴壁的脂肪干细胞胞质回缩，细胞间隙不断增大，细胞呈近球形同时有少量圆形细胞脱壁时，加入等体积的培养基终止消化；3)用吸管反复有序轻轻吹打瓶壁上的细胞（动作要轻柔，注意不要产生气泡），使细胞脱离瓶壁

4、后呈单细胞悬液；4)将单细胞悬液移至离心管中，离心，(1000rpm,5min)，弃上清，加入完全培养基，轻吹使之松散，按1:2传代培养；1)显微镜下逐日观察传代培养的细胞，待贴壁细胞达到90%以上融合时，再进行传代，如此反复。3.脂肪干细胞的冻存将传代培养的细胞悬液以1×106cells/ml的比例加入预冷冻存液（含5%DMSO，30%胎牛血清的DMEM），充分混匀后置预冷的冻存管中。将冻存管置于-80°C低温冰箱中过夜后，投入液氮中保存。4.脂肪干细胞的复苏1)取出液氮中的冻存管，迅速投入37°C水浴中快速晃动，直至冻存液完全溶解，复

5、温在1-2分钟内完成；2)用酒精棉球擦洗存有细胞的冻存管以减少污染；3)无菌条件下吸出细胞悬液至离心管中，补加4ml培养基后离心(1000r/min,5min)，弃上清；4)收集细胞，用培养基吹打成细胞悬液接种在培养瓶中，于37°C,5%CO2培养箱中培养。