探索人吸脂来源的干细胞与脂肪细胞共培养的研究

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1、大连理工大学硕士学位论文人吸脂来源的干细胞与脂肪细胞共培养的研究姓名：宁睿明申请学位级别：硕士专业：化学工程指导教师：刘天庆20090701大连理工大学硕士学位论文摘要脂肪干细胞不仅具有跟骨髓间充质干细胞相似的多向分化潜能，而且具有取材方法简便、来源广泛、患者创伤小等优势，这都使其成为近年来干细胞研究领域中的热点。干细胞应用的一个重要方向就是脂肪组织工程，由于脂肪干细胞具有上述优点，这无疑令脂肪干细胞成为构建工程脂肪组织的种子细胞的最佳选择，如何实现脂肪干细胞的成脂分化，是构建工程脂肪组织重要的研究课题。本实验目的在于

2、对通过共培养人体吸脂来源的脂肪干细胞与脂肪细胞，促使脂肪干细胞进行成脂分化，并通过各种生物学检测手段，观察干细胞经过共培养后的成脂分化效果。具体方法是：首先采用胶原酶消化的方法，从吸脂手术来源的人体脂肪组织中，分别分离得到人体脂肪干细胞和脂肪细胞。对分离得到的脂肪细胞在显微镜下进行细胞形态观察、特异性的油红O染色并拍照观察、台盼蓝死活染色并拍照观察、脂肪细胞的培养观察等鉴定检测的实验；对于分离得到的脂肪干细胞在显微镜下进行细胞形态观察、eck．8法检测动力学生长曲线、对脂肪干细胞成脂诱导后进行特异性的油红O和台盼蓝复合

3、染色实验、Hoechst荧光染色、流式细胞仪进行细胞表面抗原的检测。通过以上的实验观察和检测，证明本实验收获的细胞确实为形态完整，功能健全的脂肪干细胞和脂肪细胞。接下来把分离得到的人体吸脂来源的脂肪干细胞和脂肪细胞分别采用l：5，l：l，2：1和5：l四个比例，在Transwell中进行共培养。采用脂质染料油红O和细胞核染料台盼蓝对共培养后的脂肪干细胞进行染色，显微镜下拍照观察细胞形态，并计算成脂分化率。同时，通过混合成脂诱导方法诱导脂肪干细胞，并以此为成脂分化的阳性对照组，以不加任何诱导剂的普通培养基培养的脂肪干细胞

4、为成脂分化的阴性对照组。结合共培养对照组，分析考察了本实验共培养条件下，各个不同细胞比例培养组之间，成脂诱导分化效果的差异。实验结果证明：用脂肪干细胞与脂肪细胞的共培养这种方式，共培养8天内尚不能促使脂肪干细胞成脂分化。对于未能实现干细胞成脂分化的原因可能有如下两点：一是共培养时间过短所致。第二点原因则可能是单纯这种干细胞与脂肪细胞共培养方法并不能实现干细胞向成脂方向的分化。鉴于以上第一点原因，本人将共培养时间延长至20天，并采用流式细胞仪分析共培养后脂肪干细胞表面抗原标记的表达。同时，对共培养后的脂肪干细胞进行了Ho

5、echst和PI的死活荧光检测。人吸脂来源的脂肪细胞与脂肪干细胞共培养的研究实验结果表明：经过20天共培养的脂肪干细胞仍未发生明显的成脂分化现象，但其表面抗原CDl05的表达发生明显降低，这可能意味着脂肪干细胞经过共培养后发生了一定程度的分化。本实验在脂肪干细胞成脂分化研究领域内，首次尝试了以利用脂肪干细胞与脂肪细胞二者间接共培养的方式进行脂肪干细胞的成脂诱导分化，并通过各种生物学检测手段对成脂分化共培养后的脂肪干细胞进行了分化效果的检验，对进一步研究脂肪干细胞的成脂诱导方法和机理具有指导意义。关键词：脂肪细胞；脂肪干

6、细胞；共培养；成脂分化；油红0染色大连理工大学硕士学位论文Co--cultureofhumanadipose··derivedstemcellsandmatureadipocytesAbstractJustlikebonemarrowmesenchymalstemcells(BM-MSCs)，aidposederivedstemcells(ADSCs)havethecapacityofmulti-differentiation．However,ADSCscanbeisolatedeasilywithabundantrc

7、soBrcesandlittleinjurytopatients．ThusmoreandmoreresearchersbecameinterestedinthestudyofADSCs．OneoftheimportantapplicationsofADSCsisTissueEngineering．It’SveryclearthatADSCsarethemostsuitableseedcellsfortheconstructionofengineeringadiposetissues．Thus,itismeaningfu

8、ltOstudytheadiposedifferentiationofADSCs．Inthispaper,ADSCsandmatureadipocyteswereisolatedfromhumanliposuctionedadiposetissue．Observationincellmorphology，OilRedOassay，