资源描述：
《【精品】细胞培养方法总结.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、细胞培养无菌操作基本技术1.实验进行前，无菌室及无菌操作台仃aminarflow）以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70%酒精擦拭无菌操作抬而，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理•株细胞株，口即使培养基和同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株Z操作。2.无菌操作工作区域应保持淸洁及宽敞，必要物殆，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70%ethano
2、l擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央10-30cm无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。3.小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶II,亦不要在打开之容器止上方操作实验。容器打开后，以于夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45。角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。4.工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验°对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台（至少ClassII）o操作过程中，应避免引起悬浮微粒（aerosol）之产生，小心毒性药品，例如二甲基亚砚（DMSO）等，并避免尖锐针头之伤害等。5.定期检测
3、下列项目：a.C02钢瓶之C02压力b.C02培养箱ZC02浓度、温度、及水盘是否有污染（水盘的水用无菌水，每周更换）。c.无菌操作台内Zairflow力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网（300小时/预滤网,3000小时/HEPA）o6.水槽可添加消毒剂（Zephrin1:750）,定期更换水槽的水。常用细胞分散剂与作用原理1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的竣基和其他氨基酸的氨基Z间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解1伯使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从1佃使细胞分散。3、灰色链丝菌酶：山灰色链丝菌提取的一•种酶制剂，是
4、蛋白酶、氨肽酶和竣肽酶的混合物。营养液1、人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酚、瞟吟、唏唳、辅助生长因子。2、血清1）血清的种类胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清,英中以新生犊牛血清使用最为广泛。2）血清的处理无菌采集,过滤除菌。用前56°C灭活30mino培养基1.液体培养基贮存于4oC冰箱，避免光照，实验进行前放在37oC水槽屮温热。2.液体培养基(加血淸)存放期为六个月，期间glutciinine可能会分解，若细胞生长不佳,可以再添加适量glutamineo3.粉末培养基配制(以1升为例)：3.1.细胞培养基通常须添加10%
5、血清，因此粉末培养基之配制体积为900ml,pH为7.2-7.4。NaHC03为另外添加,若将NaHC03粉末直接加入液体培养基中会造成pH之误差,或局部过碱。I大I此粉末培养基及NMIC03粉末应分别溶解后才混合，然后用C02气休调整皿，而非用强酸(HC1)或强碱(NaOH),因为氯离子对细胞生长可能有影响,且贮存时培养基的pH易发生改变。抗生素1.细胞库之细胞培养基不加抗生素1.1.培养自ATCC引进之细胞株，培养基中不加抗生素。1.2.培养自其它实验室引进之细胞株，制作tokenfreeze前培养基须添加抗生索，待tokenfreeze通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。2
6、.寄送活细胞时,须将培养液充满整个flask时，则须添加抗生素(penicillin100units/ml+streptomycin100ug/ml)。3.若要检测mycoplasma,则培养基内不可添加gentamicin,因gentamicin会抑制mycoplasma生长。4.去除细菌污染之抗生素混合配方:penicillin250units/ml,streptomycin250ug/ml,neomycin250ug/ml,bacitracin2.5units/ml,注意混合使用后药物毒性会增强。5.抗生素使用种类与浓度：工作浓度.储存温度.杀灭细菌penicillin100u
7、nits/ml-20°CG(+)bacteriastreptomycin100ug/ml-20°CG(+)andG(-)bacteriachlotetracycline50ug/ml-20°CG(+)andG(-)bacteriagentamicin50ug/ml-20°CG(+)andG(-)bactetia,mycoplasmaamphotericinB2.5ug/ml-20°Cyeastandmoldsnystatin50ug/ml-20°Cyeas
