资源描述：
《常规细胞培养方法.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、常规细胞培养初代培养原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种胡（常用J1夷蛋白晦）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至37D,培养瓶、青霉索瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37°C）材料：动物组织块试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶,Hank's液，碘酒初代消化培养法1.准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。2.布局：点燃酒精灯，安装
2、吸管帽。3.处理组织:把组织块置于烧杯中,用Hanks液漂洗2-3次,去除血污;如怀疑组织可能污染,可先置于含有青链事索的混合液屮30-60分钟。4.剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。5.消化：或用恒温水浴，或置于37C温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。6.分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织己分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化
3、开的组织块。低速（500-1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适最含有血清的培养液。7.计数:用计数板计数,如细胞悬液细胞密度过大,再补加培养液调整后,分装入培养瓶中。对大多数细胞来说,pH要求在7.2-7.4范用，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。8.培养：置于36.5°C温箱培养,如用CO2温箱培养，瓶II需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生靂菌,每次换液时需要换新塞。初代组织块培养法1・剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉索小瓶中,用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。2.摆布：用弯头吸管吸取若干小
4、块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜,每一25ml培养瓶底可摆布20-30块。3.轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5°C温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。4•培养：从微箱屮取出培养瓶，开塞,46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许,然后缓缓再把培养瓶翻转过來，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的纽织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。传代培养法原理细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数最扩大,就必须进行传代（再培养）。传代
5、培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。材料和试剂1.细胞：贴壁细胞株2.试剂：0.25%胰酶、1640培养基（含10%小牛血清）3.仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等操作步骤1・吸除培养瓶内IIJ培养液。2•向瓶内加入胰蛋口和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限。3.置温箱中2〜5分钟，当发现细胞质回缩,细胞间隙增大后,立即终止消化。4•吸除消化液,向瓶内注入Hanks液数毫升,轻轻转动培养瓶,把残余消化液冲掉。注意加Hanks液冲洗细胞时,动作要轻,以免把已松动的细胞冲掉流失
6、,如用膜蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后,可不用Hanks液冲洗，直接加入培养液。5.用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。6.计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶屮，置温箱屮培养。无菌操作注意事项1.操作前要洗手，进入超净台后乎要用75%酒耕或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。2•点燃酒粘灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。3.操作动作要准确擞捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。4.不能用手触已消毒器川L的工作部
7、分，工作台面上用品要布局合理。5•瓶子开口后要尽最保持45°C斜位。6•吸溶液的吸管等不能混用。
