常规细胞培养方法

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1、贴壁细胞系的传代改编自Freshney,R.I.,1994。动物细胞培养：基本技术手册。第3版，Wiley-Liss，纽约，美国。概述讨论从培养容器中去除培养基，PBS5.加入含有血清的培养基（3–10mL/75cm2血清中含有胰蛋白酶的抑制剂。漂洗一下，将胰蛋白酶加入细胞，孵瓶面积），上下吹打细胞，直到细胞分因此在第2步处理的时候，去除痕量的育，加入含有血清的培养基终止胰蛋散成单细胞悬液。血清非常重要。白酶的反应，分散细胞，稀释后放回培养箱。6.用血球计数板或库尔特粒度仪计数第5步中培养基中含有的血清会使并将细胞稀

2、释到合适的接种浓度。残留的胰蛋白酶失活并保护细胞免受1.吸去用过的培养基并丢弃之。伤害。如果使用无血清培养基，则可7.向含有培养基的新的细胞培养瓶中能需要另外添加胰蛋白酶的抑制剂如2.向培养瓶中加入PBS（10mL/75加入适当体积的细胞悬液。大豆胰蛋白酶抑制剂。胰蛋白酶的孵cm2瓶面积），注意不要扰动单细胞育时间和分散细胞成为单细胞悬液使层。轻轻前后摇动培养瓶以漂洗单细8.将培养瓶放入培养箱，拧松瓶盖1/4用的力度根据不同的细胞株也有所不胞层。然后去除PBS。圈，以便气体交换。同。有必要调整这些参数来适应您所培养的

3、细胞。3.加入胰蛋白酶(3mL/75cm2瓶面积)，然后摇动培养瓶以保证整个单细胞层都被胰蛋白酶溶液覆盖。4.孵育至细胞开始脱壁，通常3-5分钟。需要注意不要使细胞暴露在胰蛋白酶溶液的时间过长。还要注意不要在细胞消化不充分的情况下强行使之脱壁，这样容易使细胞聚集成团。78未命名-222013/3/517:35:17贴壁细胞系的传代细胞活力分析改编自Freshney,R.I.,1994。动物细胞培养：基本技术手册。第3版，Wiley-Liss，纽约，美国。改编自Freshney,R.I.,1994。动物细胞培养：基本技

4、术手册，第3版，Wiley-Liss，纽约，美国。细胞培养方法介绍概述讨论细胞活力分析可以测定细胞悬液1.制备用于分析的细胞悬液（大约106中存活细胞的百分比。一般通过染料个细胞/毫升）。从培养容器中去除培养基，PBS5.加入含有血清的培养基（3–10mL/75cm2血清中含有胰蛋白酶的抑制剂。排除的染色方法实现，即具有完整细漂洗一下，将胰蛋白酶加入细胞，孵瓶面积），上下吹打细胞，直到细胞分因此在第2步处理的时候，去除痕量的胞膜的细胞能够将染料排除在外从而2.制备用0.4%台盼蓝溶液(SV30084.01)育，加入含

5、有血清的培养基终止胰蛋散成单细胞悬液。血清非常重要。不被染色，而不具备完整细胞膜的细1：1稀释的细胞悬液。白酶的反应，分散细胞，稀释后放回胞则能够吸收染料而被染色。培养箱。6.用血球计数板或库尔特粒度仪计数第5步中培养基中含有的血清会使3.将稀释液加入血球计数板的计数池中并将细胞稀释到合适的接种浓度。残留的胰蛋白酶失活并保护细胞免受用于排除染色法的染料通常选择（见血球计数板）。1.吸去用过的培养基并丢弃之。伤害。如果使用无血清培养基，则可台盼蓝，但是赤藓红和萘黑也常被使7.向含有培养基的新的细胞培养瓶中能需要另外添加

6、胰蛋白酶的抑制剂如用。吸收染料的染色方法也可以用于4.静置1-2分钟（时间不要太长，否则2.向培养瓶中加入PBS（10mL/75加入适当体积的细胞悬液。大豆胰蛋白酶抑制剂。胰蛋白酶的孵测定细胞活力。这种情况下，染料被活细胞也会死亡并开始吸收染料）。cm2瓶面积），注意不要扰动单细胞育时间和分散细胞成为单细胞悬液使活细胞正常吸收，而死细胞则不会。层。轻轻前后摇动培养瓶以漂洗单细8.将培养瓶放入培养箱，拧松瓶盖1/4用的力度根据不同的细胞株也有所不例如双乙酰荧光素就是这类染色方法5.用血球计数板计算被染色的细胞数和胞层。

7、然后去除PBS。圈，以便气体交换。同。有必要调整这些参数来适应您所中所使用的染料。总细胞数。培养的细胞。3.加入胰蛋白酶(3mL/75cm2瓶面台盼蓝染色的方法应用较为广6.未被染色的细胞百分比则代表了活细积)，然后摇动培养瓶以保证整个单细泛，操作方法如下所述：胞的百分比。胞层都被胰蛋白酶溶液覆盖。4.孵育至细胞开始脱壁，通常3-5分钟。需要注意不要使细胞暴露在胰蛋白酶溶液的时间过长。还要注意不要在细胞消化不充分的情况下强行使之脱壁，这样容易使细胞聚集成团。7879未命名-232013/3/517:35:17HyQT

8、ase和胰酶消化操作方法用于传代和扩增的细胞脱壁步骤步骤1.显微镜检测细胞以保证细胞生长6.中和：汇合度为60-90%，细胞形态正常，无微生物污染。a.如果使用HyQTase，则不需要中和的步骤。一旦所有的细胞都脱2.融化细胞脱壁用溶液（胰蛋白酶壁了，无菌去除HyQTase溶液，SH30236.01或HyQTaseSV30030.01）然后简单