[精品]巨噬细胞培养.doc

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1、细胞培养准备一、实验器材：1・培养瓶离心管注射型滤器（正床过滤器）2•手术器材：银子手术剪止血钳注射器针头3.包装用品支架：饭盒包装纸硫酸纸棉线准备：1.清洗：刷洗，煮沸后加洗剂冲洗，振荡冲洗15-20次酸泡，烤干后泡24h浸泡，去离子水2次,每次24h,新玻璃器材5%HCL2.包装：瓶管口，双层纸；盖玻片条；瓶塞；吸管，管底垫棉花，管头塞棉花;饭盒：盒底垫纱布，瓶口向下，液体瓶插针头，盖纱布、盖子滤菌器，双层滤纸3.消毒高圧蒸汽，紫外线，滤过消毒化学消毒，酒精，新洁尔灭，过氧乙酸（无菌室），火焰消毒二、实验仪器

2、：CO2培养箱：电源，温度，湿度，5%CO2注意事项：1.定期紫外线，酒精消毒2.CO2气压定期测试3.供气屮断拧紧瓶盖4.定期加水，保持湿度5.培养瓶酒精消毒入箱倒置显微镜普通光学显微镜24孔培养板酸度计蒸汽灭菌器离心机超净工作台血球计数板三、药品及细胞用液:之后将乙液缓缓加入甲液用滤纸滤过后，加入氯仿)倍，经116°C,15分twobig药品：75%酒精，0.4%台盼蓝I.平衡盐溶液:HANK'S液：甲液：NaCl80.0gKC14.0gCaC12l.4gMgSO4-7H2O2.0g乙液：Na2HPO4•12

3、H2O1.52gKH2PO40.6g葡萄糖lO.Og丙液：1%酚红溶液16ml将甲、乙各种试剂按顺序分别溶于450ml蒸倔水屮,屮，边加边搅拌，再加入内液，补蒸水至1000ml,2.0ml,置于2・8°C保存。使用时，用蒸饰水稀释钟灭菌。使用前用7・5%NaHCO3调pH至7.2-7.4o0.01MPBS(pH7.2-7.6)：8.5gNaClNa2HPO41.4gNaH2PO40.2g溶于1()()()ml蒸锚水屮。Twobig2.天然培养基：胎儿牛血清twosmall3.消化液：膜酶液，胶原酶液，0.3%ED

4、TA,TE4•青链霉素溶液：10mlHANK'S液屮溶解100万单位硫酸链霉素配成硫酸链霉素溶液，取出8ml硫酸链霉索溶液溶解80万单位的青霉索钠配成每毫升青霉索、链霉素各10万单位的母液。使用吋，在100ml培养基屮加母液0.1ml,则培养基内青霉索、链霉素最终使用浓度为100单位/ml。5.10%RPMI1640培养基1640培养基90ml屮加入10ml胎牛血清混匀，置4°C冰箱短期备用。Onebig1.酸性磷酸酶作用液：蒸耀水90ml0.2mol/L醋酸缓冲液(pH4.6)12ml5%硝酸铅2ml3.2%0

5、■甘油磷酸钠4ml先将蒸倔水和醋酸缓冲液混合，随后分成大致相等的两份，一份屮加醋酸铅溶液,另一份加片油磷酸钠溶液，然后再将两者缓缓混合，边混匀边搅匀。若pH>5.0,可加少许醋酸调节，临用前配置。配好后的作用液应透明无絮状悬浮物和沉淀,否则严重影响实验结果。Onebig2.吉姆萨染液:吉姆萨染料(粉末)0.8g甲醇50ml甘油50ml先将吉姆萨染料放入乳钵屮，逐渐倒甘油研磨溶于甘油屮，置于56C水温箱内，90-120分钟，然后加入甲醇，摇匀后放置数天，过滤后或不过滤即对使用。此染液放置室温阴暗处，吋间越长越好。使

6、用染液可临吋配置：姬姆萨染液1ml,加l/15mol/L磷酸盐缓冲液10ml混匀，即可使用。Onebig10%多聚甲醛缓冲液:4g50ml多聚甲醛蒸锚水在通风橱内加热使之解聚，完全溶解，冷却，用0.2mol/LPB(pH7.4-7.5)定容致100mlo细胞培养过程小鼠腹腔巨噬细胞的培养与纯化（1）实验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌RPMI16401ml（勿注入肠内）,以刺激腹腔产生大量的巨噬细胞。51注射器（2）三天后引颈处死小鼠，手提鼠尾将小鼠全浸入75%乙醇屮3-5秒。烧杯（3）置小鼠于超净工作台屮的灭菌托盘

7、屮，持锡撕开腹部皮肤，但勿伤及腹膜壁，暴露出腹膜壁。用75%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸2-3mlRPMI1640液注入腹腔屮，同吋用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动。用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧。使腹腔屮液体集屮于针头下吸取入针管内，小心拔出针头，把液体注入离心管。5ml（4）1000转离心10分钟后，去上清，加RPMI1640（含100单位/ml青链霉素，10%无支原体胎牛血清）培养基重新混匀。（5）用RPMI1640（含100单位/ml青链霉素,10%无支原体胎牛血清）接种于有盖玻片的培养瓶屮进行原代培

8、养，放入CO2培养箱屮（37°C,5%CO2）培养2-3小时。（6）除去培养液，用Hanks液冲洗培养孔2-3次，去除未贴壁细胞，纯化巨噬细胞，再用RPMI1640液冲洗1・2次,再加入RPMI1640（10%无支原体胎牛血清）培养液备用。（7）细胞的传代培养（8）普通光镜下细胞计数，鉴定，检测活性小鼠腹腔巨噬细胞的鉴定用酸性磷酸酶法鉴定口噬细胞。（1）取出有细胞贴壁的盖