3_聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段.ppt

《3_聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、实验三聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段1实验目的和要求学习和掌握PCR基因扩增的原理和操作方法，并深刻理解PCR基因扩增技术在DNA操作中的重要性。本实验以2.5kb的质粒为模板，扩增出约500bp的产物。22原理多聚酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)：是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法。类似于DNA的变性和复性过程解链退火延伸3PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DN

2、A片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃4PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃引物1引物2DNA引物5PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶6PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始7PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq8PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2

3、轮结束9PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增10如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的指数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。113、PCR反应系统的组成PCR反应系统的组成主要包括：引物、寡核苷酸、TaqDNA聚合酶、模板DNA、缓冲液。12引物：要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核苷

4、酸引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段。*两引物间距离决定扩增片段的长度，*两引物的5’端决定扩增产物的两个5’末端位置。由于引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键，因此，引物设计也就更为重要。13PrimerIPrimerIIAmplifiedtargetfragment14引物的设计：长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过30个核苷酸，最佳长度为20～24个核苷酸。有时可在5’端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点或增强因子等，以完成基因克隆和其它特殊需要，但要在酶切位点的5‘端加上额外的3－4个核苷

5、酸，以确保附加的酶切位点有效。两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成“引物二聚体”。(G+C）%含量引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（G+C）%含量应尽量相似。引物内部应避免内部形成发夹结构15引物在PCR反应中的浓度一般在0.1～1μM之间。*浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异性产物。*一般来说用低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完成30个循环的扩增反应，则会降低PCR的产率。16引物退火温度决定PCR特异性与产量*温度高特异性强，但过高则引

6、物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；*温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。可根据引物的（G+C）%含量进行推测，一般实验中退火温度比扩增引物的融解温度Tm低5℃，可按公式进行粗略计算：Ta=Tm-5℃=4(G+C)+2(A+T)-5℃17引物延伸温度的选择取决于DNA聚合酶的最适温度。一般取70～75℃，在72℃时酶催化核苷酸的标准速率可达35～100个核苷酸/秒。引物延伸温度18寡核苷酸（dNTP）在PCR反体系中,dNTP终浓度高于50mM会抑制Taq酶的活性,高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度太低，可降低

7、反应物的产量。PCR常用的浓度为50～200μM，不能低于10～15μM。四种dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应。19TaqDNA聚合酶最早是从嗜热水生菌中提纯出来的。PCR反应混合物中，催化一典型的PCR所用酶量5U/100μl。由于DNA模板的不同和引物不同，以及其它条件的差异，聚合酶的用量亦有差异，酶量过多会导致非特异产物的增加。TaqDNA聚合酶:20模板的种类：单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一条cDNA。用质粒作

8、模板时，线性化的比环状的效果好，但在实际操作中，往往不需要将质粒线性化，而直接用做模板。当使用高分子量的DNA（如基因组DNA）做模板时，如果用适当的