人补体受体1型活性片段SCR15-18在毕赤酵母中的表达,纯化及活性鉴定

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1、人补体受体1型活性片段SCR15-18在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定刘高科，何莉，杨永涛，汪正清(第三军医大学基础医学部微牛物教研室，重庆400038)摘要：目的实现人补体受体1型(complementreceptortype1,CR1)活性片段SCR15-18在毕赤酵母屮的分泌表达。方法用PCR从原核表达质粒pET32a-sCRl-SCR15-18上扩增CR1-SCR15-18的编码基I大I,并克隆到毕赤酵母分泌表达质粒pPIC9,构建重组质粒PPIC9-CR1-SCR15-18，鉴定后测序；重组质粒电转化整合到毕赤酵母GS115基因组中，菌落PCR技术筛选阳性

2、转化株；经摇瓶发酵和甲醇诱导，SDS-PAGE和Westernblot鉴定目的蛋白的表达；Ni2+-NTAagarose亲和层析纯化目的蛋白，并用体外抑制补体溶血反应试验测定目的蛋白的生物活性。结果成功分泌表达了CR1-SCR15-18蛋白，口的蛋白能够明显抑制补体的体外溶血。结论在毕赤酵母屮成功实现了CR1-SCR15-18蛋白的分泌表达，该蛋白具冇较高的抑制补体溶血的生物活性。关键词：补体受体1型；毕赤酵母；分泌表达；补体溶血中图法分类号：文献标识码：ExpressionPurificationandActivityIdentiHcationofSCR15-18d

3、omainofHumanCR1inPichiaPastorisLIUGao-ke,HELi,YANGYong-tao,WANGZheng-qing(Departmentofmicrobiology,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing,400038,China)Abstract:ObjectiveToexpressSCR15-18domainofhumanCR1inPichiapastorisasasecretedproteinformakingafoundationoflarge-scaleindustryfementat

4、ion.MethodsThegeneofCR1-SCR15-18wasamplifiedbyPCRfrompET32a-sCR1-SCR15-18.TheobtainedsequencewasclonedintoPichiapastorissecretoryexpressionvectorpPIC9；AfteridentificationtherecombinantplasmidpPIC9-CR1-SCR15-18waselectrotransformedintoPichiaPastoris；cloneswereidentifiedusingcolonyPCR；Pos

5、itiverecombinantswerefermentedinshakeflaskesandinducedwithmethanol；therecombinantproteinswereidentifiedwithSDS-PAGEandWesternblot；thebiologicalactivityoftherecombinantproteinwasdetectedbyinhibitingcomplementhemolysisinvitroafterpurificationbyNi-NTAagarosemetalchelateaffinitychromatograp

6、hy；ResultsTherecombinantproteinwas基金项目：重庆市自然科学基金资助项目(CSTC,2007BB5011)国家自然科学基金资助项目(30471723)作者简介：刘高科，男，湖南省永州市人，硕士，主要从事感染与免疫方而的研究。电话023(68752239),E-mail：lgk259@tom.com通信作者：汪正清，电话：(023)68752242,E-mail:wangzhengqing!953@126.com收稿日期：修回Fl期：successfulsecretedintoculturesupernatantandinhibitedc

7、omplementhemolysis-ConclusionCR1-SCR15-18wassuccessfulexpressedinPichiaPastoriswithhighactivityofinhibitingcomplementhemolysis.Keywords:complcmcntrcceptortype1；pichiapastorisyeast；secretoryexpression；complementhemolysis补体系统是先天和获得性免疫的重要组成部分，英活化受到一系列膜蛋白和血浆蛋白的抑制调节，但补体异常过度活化则可以引起缺血