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时间:2019-11-15
《人补体受体1型活性片段SCR15-18在毕赤酵母中的表达,纯化及活性鉴定》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、人补体受体1型活性片段SCR15-18在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定刘高科,何莉,杨永涛,汪正清(第三军医大学基础医学部微牛物教研室,重庆400038)摘要:目的实现人补体受体1型(complementreceptortype1,CR1)活性片段SCR15-18在毕赤酵母屮的分泌表达。方法用PCR从原核表达质粒pET32a-sCRl-SCR15-18上扩增CR1-SCR15-18的编码基I大I,并克隆到毕赤酵母分泌表达质粒pPIC9,构建重组质粒PPIC9-CR1-SCR15-18,鉴定后测序;重组质粒电转化整合到毕赤酵母GS115基因组中,菌落PCR技术筛选阳性转化株;经摇瓶
2、发酵和甲醇诱导,SDS-PAGE和Westernblot鉴定目的蛋白的表达;Ni2+-NTAagarose亲和层析纯化目的蛋白,并用体外抑制补体溶血反应试验测定目的蛋白的生物活性。结果成功分泌表达了CR1-SCR15-18蛋白,口的蛋白能够明显抑制补体的体外溶血。结论在毕赤酵母屮成功实现了CR1-SCR15-18蛋白的分泌表达,该蛋白具冇较高的抑制补体溶血的生物活性。关键词:补体受体1型;毕赤酵母;分泌表达;补体溶血中图法分类号:文献标识码:ExpressionPurificationandActivityIdentiHcationofSCR15-18domainofHumanCR
3、1inPichiaPastorisLIUGao-ke,HELi,YANGYong-tao,WANGZheng-qing(Departmentofmicrobiology,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing,400038,China)Abstract:ObjectiveToexpressSCR15-18domainofhumanCR1inPichiapastorisasasecretedproteinformakingafoundationoflarge-scaleindustryfementation.MethodsThegeneofC
4、R1-SCR15-18wasamplifiedbyPCRfrompET32a-sCR1-SCR15-18.TheobtainedsequencewasclonedintoPichiapastorissecretoryexpressionvectorpPIC9;AfteridentificationtherecombinantplasmidpPIC9-CR1-SCR15-18waselectrotransformedintoPichiaPastoris;cloneswereidentifiedusingcolonyPCR;Positiverecombinantswereferment
5、edinshakeflaskesandinducedwithmethanol;therecombinantproteinswereidentifiedwithSDS-PAGEandWesternblot;thebiologicalactivityoftherecombinantproteinwasdetectedbyinhibitingcomplementhemolysisinvitroafterpurificationbyNi-NTAagarosemetalchelateaffinitychromatography;ResultsTherecombinantproteinwas基
6、金项目:重庆市自然科学基金资助项目(CSTC,2007BB5011)国家自然科学基金资助项目(30471723)作者简介:刘高科,男,湖南省永州市人,硕士,主要从事感染与免疫方而的研究。电话023(68752239),E-mail:lgk259@tom.com通信作者:汪正清,电话:(023)68752242,E-mail:wangzhengqing!953@126.com收稿日期:修回Fl期:successfulsecretedintoculturesupernatantandinhibitedcomplementhemolysis-ConclusionCR1-SCR15-18w
7、assuccessfulexpressedinPichiaPastoriswithhighactivityofinhibitingcomplementhemolysis.Keywords:complcmcntrcceptortype1;pichiapastorisyeast;secretoryexpression;complementhemolysis补体系统是先天和获得性免疫的重要组成部分,英活化受到一系列膜蛋白和血浆蛋白的抑制调节,但补体异常过度活化则可以引起缺血
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