人羧肽酶a1活性中心的毕赤酵母可溶表达

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1、人羧肽酶A1活性中心的毕赤酵母可溶表达【关键词】人羧肽酶【Abstract】AIM:ToexpressthehumancarboxypeptidaseA1(CPA1)activecenterproteininsolubleforminpichiayeast.METHODS:HumanCPA1activecentergeneplifiedfrompGEXCPA1rebinantplasmidandsubclonedintopPIC9Kyeastexpressionvector.RebinantvectorpPIC9KCPA1activecenteredintop

2、ichiaSMD1168byelectroporation.PositiverebinantyeaststrainsulticopyrebinantyeaststrainsanCPA1activecenterproteininpichiayeastafterscreenedanCPA1activecenterproteinhasbeenexpressedsuccessfullyinpichiayeast,eprodrugtherapy，ADEPT)中，CPA即被用作识别前药的专一活化酶［2］，它特异性切割前药的特定残基，使其在肿瘤组织中活化，增加了药物的特异性

3、，减少了其对正常组织的毒副作用.本研究组应用人CPA1对前列腺癌ADEPT疗法进行了多年研究，已克隆并在大肠杆菌中表达了CPA1活性中心基因［3］.由于原核表达的局限性影响了CPA1的生物活性.为了得到结构和生物学活性更接近人CPA1的蛋白，我们拟采用Pichia酵母真核表达系统(SMD1168宿主细胞)分泌表达人CPA1活性中心蛋白，为人CPA1活性中心蛋白在前列腺癌ADEPT疗法中的应用奠定基础.1材料和方法1．1材料毕赤酵母菌SMDI1168(his4，pep4)由第四军医大学微生物学教研室提供；大肠杆菌DH5α和毕赤酵母表达质粒pPIC9K由第四军医大

4、学生物化学与分子生物学教研室提供；pGEXCPA1activecenter重组质粒由第四军医大学西京医院检验科构建；限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶均为TaKaRa公司产品；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒为Promega公司产品；其他试剂均为分析纯，电穿孔仪和蛋白电泳仪购自BioRad公司.1．2方法1．2．1引物设计及基因扩增根据文献［4］报道的CPA1活性中心基因序列设计引物，由上海生工生物工程公司合成，其中正向引物P1的5′端引入EcoRI酶切位点，反向引物P2的5′端引入NotI酶切位点.P1:5′GGAATTCATGATCGACACG

5、GGCATCCATTC3′；P2：5′AGCGGCCGCTCAAGTGTCCCGGAGCTCGAA3′.用上述引物进行PCR扩增，反应体系组成：模板0.5μL，引物各12.5pmol，2.5mmol/LdNTP2μL，10×PCR缓冲液2.5μL（含MgCl2），TaqDNA聚合酶0.5U，再用去离子水补至25μL.循环参数为94℃5min后，94℃变性0.5min，55℃退火0.5min，72℃延伸2min，经过30个循环，最后72℃延伸7min．PCR产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定结果.1．2．3转染毕赤酵母菌约10μg的pPIC9KCPA1activ

6、ecenter的质粒DNA用BglII酶切线性化，然后用电穿孔法转入毕赤酵母感受态细胞并涂布在缺组氨酸的MD平板(13.4g/L酵母含氮碱基；20g/L葡萄糖；4×10-5g/L生物素；15g/L琼脂)上.pPIC9K质粒含有卡那霉素抗性基因，其转染的宿主菌能抗氨基糖甙类抗生素(G418).采用含不同浓度(0．5～4.0g/L)G418的YEPD平板(10g/L酵母提取物；2g/L蛋白胨；2g/L葡萄糖；20g/L琼脂)来筛选高拷贝转化子.1．2．4PCR检测CPA1活性中心基因与毕赤酵母染色体基因组的整合按照Invitrogen公司提供的方法，提取能抗4.0

7、g/LG418的毕赤酵母菌总DNA，用PCR法检测CPA1活性中心基因与毕赤酵母染色体基因组的整合，在相同的条件下,用pPIC9KCPA1activecenter质粒DNA，pPIC9K质粒DNA和pPIC9K空质粒转化的毕赤酵母菌总DNA作对照.1．2．5人CPA1活性中心基因的表达和鉴定挑取抗4.0g/LG418的阳性克隆接种于100mLBMGY（13．4g/LYNB，4×10-5g/L生物素，100mL/L磷酸缓冲液，10mL/L甘油）培养液中.30℃，250r/min振摇至菌浓度A600nm为2～8.离心收集菌体弃去BMGY培养液，换15mLBMMY（

8、13.4g/LYNB；4×10-5g/