人羧肽酶a1活性中心的毕赤酵母可溶表达

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1、人羧肽酶A1活性中心的毕赤酵母可溶表达易静，郝晓柯，苏明权，岳乔红，刘家云，张瑞，雷迎峰【关键词】人羧肽酶【Abstract】AIM:ToexpressthehumancarboxypeptidaseA1(CPA1)activecenterproteininsolubleforminpichiayeast.METHODS:HumanCPA1activecentergeneplifiedfrompGEXCPA1rebinantplasmidandsubclonedintopPIC9Kyeastexpressionvector.Rebinantve

2、ctorpPIC9KCPA1activecenteredintopichiaSMD1168byelectroporation.PositiverebinantyeaststrainsulticopyrebinantyeaststrainsanCPA1activecenterproteininpichiayeastafterscreenedanCPA1activecenterproteinhasbeenexpressedsuccessfullyinpichiayeast,eprodrugtherapy，ADEPT)中，CPA即被用作识别前药的专一

3、活化酶〔2〕，它特异性切割前药的特定残基，使其在肿瘤组织中活化，增加了药物的特异性，减少了其对正常组织的毒副作用.本研究组应用人CPA1对前列腺癌ADEPT疗法进行了多年研究，已克隆并在大肠杆菌中表达了CPA1活性中心基因〔3〕.由于原核表达的局限性影响了CPA1的生物活性.为了得到结构和生物学活性更接近人CPA1的蛋白，我们拟采用Pichia酵母真核表达系统(SMD1168宿主细胞)分泌表达人CPA1活性中心蛋白，为人CPA1活性中心蛋白在前列腺癌ADEPT疗法中的应用奠定基础.1材料和方法1．1材料毕赤酵母菌SMDI1168(his4，pe

4、p4)由第四军医大学微生物学教研室提供；大肠杆菌DH5α和毕赤酵母表达质粒pPIC9K由第四军医大学生物化学与分子生物学教研室提供；pGEXCPA1activecenter重组质粒由第四军医大学西京医院检验科构建；限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶均为TaKaRa公司产品；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒为Promega公司产品；其他试剂均为分析纯，电穿孔仪和蛋白电泳仪购自BioRad公司.1．2方法1．2．1引物设计及基因扩增根据文献〔4〕报道的CPA1活性中心基因序列设计引物，由上海生工生物工程公司合成，其中正向引物P1的5＇端

5、引入EcoRI酶切位点，反向引物P2的5＇端引入NotI酶切位点.P1:5＇GGAATTCATGATCGACACGGGCATCCATTC3＇；P2：5＇AGCGGCCGCTCAAGTGTCCCGGAGCTCGAA3＇.用上述引物进行PCR扩增，反应体系组成：模板0.5μL，引物各12.5pmol，2.5mmol/LdNTP2μL，10×PCR缓冲液2.5μL（含MgCl2），TaqDNA聚合酶0.5U，再用去离子水补至25μL.循环参数为94℃5min后，94℃变性0.5min，55℃退火0.5min，72℃延伸2min，经过30个循环，最后7

6、2℃延伸7min．PCR产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定结果.1．2．2重组表达载体的构建及鉴定纯化PCR产物，用EcoRI和NotI进行双酶切，所获片段亚克隆到经同样双酶切的pPIC9K载体中，得到的重组表达质粒转化DH5α感受态细胞，经氨苄青霉素筛选，阳性克隆送上海生工生物工程公司测序，鉴定所插入的片段序列及构建载体的读码框架.经序列分析后，所得正确的重组表达质粒命名为pPIC9KCPA1activecenter.1．2．3转染毕赤酵母菌约10μg的pPIC9KCPA1activecenter的质粒DNA用BglII酶切线性化，然后用电穿

7、孔法转入毕赤酵母感受态细胞并涂布在缺组氨酸的MD平板(13.4g/L酵母含氮碱基；20g/L葡萄糖；4×10-5g/L生物素；15g/L琼脂)上.pPIC9K质粒含有卡那霉素抗性基因，其转染的宿主菌能抗氨基糖甙类抗生素(G418).采用含不同浓度(0．5～4.0g/L)G418的YEPD平板(10g/L酵母提取物；2g/L蛋白胨；2g/L葡萄糖；20g/L琼脂)来筛选高拷贝转化子.1．2．4PCR检测CPA1活性中心基因与毕赤酵母染色体基因组的整合按照Invitrogen公司提供的方法，提取能抗4.0g/LG418的毕赤酵母菌总DNA，用PCR

8、法检测CPA1活性中心基因与毕赤酵母染色体基因组的整合，在相同的条件下,用pPIC9KCPA1activecenter质粒DNA，pPIC9K质粒DN