两株溶藻弧菌的分子鉴别【开题报告】

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1、毕业论文开题报告生物工程两株溶藻弧菌的分子鉴别一、选题的背景与意义弧菌在水生环境中分布非常广泛，与真核生物（如鱼、虾、人等）有密切的关系。某些弧菌是重要的水产养殖动物的病原菌，有些还是人类的致病菌，严重的甚至致人死亡。然而，除了作为病原菌，弧菌在生态环境中也具有不可取代的作用。弧菌可以吸收溶解有机物质，从而对水环境中的营养循环起作用；某些弧菌可以分解几丁质，增加了氨基糖的来源；还有的弧菌可以降解多元环芳香烃以及产抗生素等。核糖体RNA（rRNA）分子存在于所有细胞生物中，rRNA基因与细菌整个基因组的变化相比，有高度的保守性。其本身的进化就反映了生物系统发育历史，因此可以用来重现所有细胞生物间

2、的进化关系。另外，由于其在细菌染色体上存在多个拷贝，现已作为标记基因广泛应用于细菌分类学和细菌的分子流行病学研究中。16SrRNA基因序列包含10个可变区(variableregion)和11个恒定区(constantregion)，可变区因细菌而异，变异程度与细菌的系统发育密切相关。迄今为止已有许多弧菌的的全序列16SrRNA基因得以破译并免费公布，十分方便进行类似序列的比较分析。随着研究的深入，逐渐建立了以16SrRNA基因为分类标准的各大数据库例如：GeneBenk、EMBL等。这些数据库为广大的分类及分子研究的科研院所以及学者提供了强大的数据支持。然而，16SrRNA基因在弧菌的分类鉴

3、定中却存在一定的问题，我们可以借助于16SrRNA基因的测序及比对分析，将弧菌鉴定到属乃至科的水平，但鉴定至种的水平就存在一定难度，因为在弧菌科中，16SrRNA序列的相似性高达97.6%以上，有些弧菌种之间的相似度甚至接近100％。因此，我们必须寻找新的用于鉴定的标志分子来增强我们对于弧菌分类的认识。随着弧菌发现的种类的增加，以及分类学中新的问题的出现，新的分子鉴定基因不断出现，用具有较高分辨率的分子基因如recA基因、gyrB基因、dnaE基因、mdh基因和gapA基因等多种基因与16SrRNA基因相结合，共同分析鉴定，从而将其精确定位。本研究采用PCR方法同时进行16SrRNA和另一种高

4、分辨基因如（recA基因等)的分子鉴定，通过序列同源性分析显示，确定该弧菌的分类学地位。该方法是一种十分方便有效的弧菌鉴定方法，可在实践中加以推广应用。此项课题为进一步探究多基因分子鉴定在弧菌鉴定上发挥的作用和寻找防治致病弧菌的新方法提供理论依据。同时为研究弧菌群落演替提供技术支撑，为揭示弧菌的生态学和流行病学规律具有重要意义。相信随着科学技术的发展，分子鉴定系统将会越来越完善，分子鉴定的精度也会越来越高，而且随着人们对基因的进一步深化了解和实验技术的发展，分子鉴定将会朝着系统化和高精度化发展，那些难以准确定位的物种终将被准确定位。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题：（一）研究的基本内容：本

5、实验主要是对采样获取的两株弧菌中提取其总DNA，获得该两株菌的16SrRNA基因和另一种标记分子，并进行分子鉴定与序列分析及进化树构建。（二）拟解决的问题：16SrRNA基因与其他高分辨基因(如recA基因等)相结合进行对弧菌进行鉴别和系统发育树分析。三、研究的方法与技术路线：（一）研究方法：1、实验材料本实验材料为从环境样品中提取出的两株弧菌，进行分离纯化后接种到培养皿培养备用。2、形态学特征和生理生化鉴定菌落大小、表面形态、边缘、质地和光泽等特征进行初步鉴别。3、总DNA提取①大试管液体扩繁，收集10ml培养液，离心；②加入2mlTE悬浮菌体，溶菌酶100ul（50mg/ml）、Rnase

6、A10ul(10mg/ml)，摇匀；水浴30min③加入120ul10%SDS和蛋白酶K(20mg/ml)10ul60℃水浴30min—1h④加入500ul5mol/LNaCl，320ulCTAB/NaCl，65℃水浴10min⑤3ml酚氯仿(25:24:1)抽提一次（一定要混匀）⑥转移上清后用等体积氯仿异戊醇(24:1)抽提1次⑦加入1/10体积的(3mol/L)NaAC，0.6体积异丙醇沉淀DNA⑧用70%的酒精洗少量多次，三次以上。第一次不用弄起DNA沉淀，第二次洗涤弄起DNA沉淀，混匀充分后洗涤。第三次重新洗涤，尽量减少DNA里面的盐分和其他杂质。⑨所得的沉淀DNA用50ul水溶解，加

7、入50ul的5mol/l的NaCl溶液，充分混匀。加入0.6倍体积的异丙醇沉淀后重新70%酒精洗涤。风干后，用25ul水溶解样品。⑩风干后，用50ul水溶解样品，-20℃保藏。4、PCR方法测定获取目的基因序列16SrRNA基因PCR扩增设计两个引物。在20tA反应体系中含有：无菌蒸馏水14.4μL，1×PCR缓冲液2μL，1.5mmol/LMgCl21.6μL，4×dNTP混合物0.4μL，引物