两株霍乱疑似弧菌的分子鉴别【开题报告+文献综述+毕业设计】

《两株霍乱疑似弧菌的分子鉴别【开题报告+文献综述+毕业设计】》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

本科毕业论文系列开题报告生物工程两株霍乱疑似弧菌的分子鉴别一、选题的背景与意义霍乱是由霍乱弧菌所致的烈怀肠道传染病。主要症状是腹泻、迅速脱水以及呕吐。弧菌的致病过程包括黏附、侵袭、体内增殖及产生毒素等，这与弧菌产生的毒力因子有关。目前发现的弧菌毒力因子有外毒素(Exotoxin)、蛋白酶(Protease)、荚膜(Capsule)、载铁体(Siderophore)及外膜蛋白(OuterMembraneProtein，OMP)等。霍乱弧菌（VibrioCholerae）中的O1群古典生物型(ClassicalBiotype，CVC)、埃尔托生物型(ElTorBiotype，EVC)和O139群霍乱弧菌能引起慢性腹泻疾病或造成局域性流行。主要通过饮水、食物和日常生活接触传播。如果不当食用已感染的水产品容易致病。霍乱弧菌的潜伏期一般1-2天，短的数小时，长的5-6天。霍乱弧菌干燥2h或加热55℃l0min即死亡，煮沸立即死亡。可以使用选择性培养基TCBS（硫代硫酸钠柠檬酸胆盐蔗糖培养基）对霍乱弧菌进行分离纯化。PCR扩增弧菌16SrDNA，并结合CT、zot、ace、slt、tcp、hly等不同毒素基因，外膜蛋白基因ompW，管家基因dnaE、hlyA、mdh、recA等进行测序及序列分析。通过本试验，促进霍乱弧菌分类鉴定方法的完善，建立起霍乱弧菌分子鉴别的方法系统，为检测霍乱弧菌预防疾病提供技术依据。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题：（一）研究的基本内容通过16SrRNA基因以及其他基因序列比较分析，分离鉴定两株养殖塘霍乱弧菌，建立起霍乱弧菌分子鉴别的方法系统，促进霍乱弧菌分类鉴定方法的完善，为检测霍乱弧菌预防疾病提供技术依据。（二）拟解决的主要问题分离鉴定两株霍乱弧菌，建立霍乱弧菌分子鉴别的方法系统。 三、研究的方法与技术路线：（一）研究的方法1.菌落分群采集样品，在选择性培养基上进行分离纯化。2.菌株形态特征分析对经纯化的菌株进行生理生化分析。3.弧菌DNA的提取3.1试剂溶菌酶缓冲液：40mMEDTA，pH8.050mMTris-cl，pH8.010％(m/V）蔗糖用0.22µm的过滤器过滤除菌，4℃保存。STE缓冲液：10mMEDTA，pH8.025mMTris-Cl，pH8.050mM葡萄糖121℃灭菌20min，4℃保存。1×工作液，pH8.0：1mMEDTA，pH8.010mMTris-Cl，pH8.0TE缓冲液：100mMTris-Cl，pH8.010mMEDTA，pH8.010×贮存液，pH8.0分装后121℃灭菌20min，室温保存。3.2SDS-煮沸法提取DNA①向M1管中加入5mlSTE缓冲液，在漩涡混合器上进行充分振荡；②加1/10体积的20％的SDS溶液(约500μl），混匀后，用沸水浴2.5min，将裂解液转移至新的无菌离心管中，-20℃，10min； ①室温离心，10000rpm，10min，弃去上清液；②用600μl的1×TE缓冲液溶解沉淀，然后将溶液转移至1.5mlEppendorf管中；③加等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液(25:24:1，v/v），用手轻轻混匀。离心，10000rpm，4min；④收集上清液，然后再加入等体积的氯仿/异戊醇溶液(24:1，v/v）混匀，离心，10000rpm，4mi⑤收集上清液，然后加入1/10体积的3M的醋酸钠和2倍体积的无水乙醇，混匀，室温沉淀10min，离心，10000rpm，10min；⑥用70％乙醇洗涤，然后再次离心，弃去上清液，自然风干，加1×TE溶液或无菌双蒸水溶解DNA，置于-20℃保存；4.16SrDNAPCR扩增测序选用细菌通用性引物对27f/1541r，扩增细菌16SrDNA的全序列，其中引物序列见表1。表1扩增不同16SrDNA片段所用引物列表Tab.1Primersfor16SrDNAamplification引物名称引物序列（5′～3′）扩增片段片段大小27FAGAPTTTGATCCTGGCTCAG16SrDNA全序列约1500bp1541RACGGCTACCTTGTTACGACT50μl的PCR反应体系组成为：10×buffer（含Mg2+）5μl正向及反向引物4μmol/LdNTP200μmol/LTaqDNA聚合酶1U模板DNA50ng补双蒸水至50μl。为获得较好的特异性产物，采用降落PCR对反应体系进行扩增。PCR反应程序（适用于引物对GC+341F和518R）： 94℃，5min；94℃，1min，60℃，1min，降落梯度为0.5℃10个循环72℃，0.5min；94℃，1min，55℃，1min，18个循环72℃，0.5min；72℃，3min。PCR产物采用1.5％(w/v)琼脂糖凝胶（含有0.5μg/ml溴化乙锭）电泳进行检测，点样量为4～5μl。5.ctxA、toxR其他基因PCR扩增测序6.序列比较分析7.结论分析（二）技术路线四、研究的总体安排与进度：2010.12查阅文献，完成任务书与开题报告，制定具体试验计划与方案。2011.01菌株纯化，16SrRNA基因测序。 2011.02其他标记基因PCR扩增测序。2011.03整理材料、完成2篇外文翻译、撰写论文。五、主要参考文献：[1]HoffmannM,BrownEW,FengPCetal..PCR-basedmethodfortargeting16S-23SrRNAintergenicspacerregionsamongVibriospecies[J].BMCMicrobiology,2010,10(1):90.[2]芮勇宇,许锐恒,阚飙等.霍乱弧菌主要毒力和管家基因序列分析[J].中国公共卫生,2006,22(1):31-33.[3]梁栋,黄秀琴.历史上危害严重的传染病病原体[J].生物学教学,2002,29(4):54-55.[4]吴后波,潘金培.病原弧菌的致病机理[J].水生生物学报,2003,27(4):422-426.[5]余长缨,韩宝芹,李静等.海洋弧菌几丁质酶的产酶条件及分离纯化研究[J].高技术通讯.2002,12(9):70-73.[6]ThompsonFL,ThompsonCC,DawyndtPetal..Phylogenyandmolecularidentificationofvibriosonthebasisofmultilocussequenceanalysis[J].Applied&EnvironmentalMicrobiology,2005,71(9):5107-5115.[7]周德庆.微生物学教程[M].第二版.北京:高等教育出版社,2002:355-356.[8]巫结冰,陈德云,胡伟宁等.弧菌显色培养基进行多种弧菌分离鉴定的研究[J].中国卫生检验杂志,2007,17(8):1451-1452.[9]谢群英,房文红,乔振国等.海水蛭弧菌分离纯化方法初步研究[J].海洋渔业,2006,18(3):211-216.[10]曹琛,黄金勇,李举鹏等.TCBS培养基在虾病防治监测中的应用[J].水产科学,2003,22(6):46-47.[11]杜明,张洁.TCBS琼脂平板在弧菌培养中的应用评估[J].医学检验进修杂志,1996,3(1):41.[12]焦振全,刘秀梅.细菌分类鉴定的分子生物学方法研究进展[J].国外医学：卫生学分册.1996,23(6):356-361.[13]金莉莉,董雪,王秋雨等.副溶血性弧菌重复序列-PCR分型研究[J].微生物学通报,2008,35(3):389-394.[14]杜联峰,杨泽,余妍等.霍乱弧菌多重PCR检测方法的建立及优化[J].现代预防医学,2010,37(1):101-102,114.[15]刘毅,韩金祥,黄海南等.膜微阵列技术的建立及检测细菌条件的优化[J].临床检验杂志,2003,21(4):221-223.[16]王洪敏,柯昌文,潘武滨等.2005年广东省临床分离猪链球菌的MLST分子分型研究[J].南方医科大学学报,2008,28(8):1438-1441,1445.[17]刘静.AFLP分子标记的发展及应用[J].山东农业科学,2010,5:10-14.[18]PascualJ,M.CarmenMacián,ArahalDRetal..MultilocussequenceanalysisofthecentralcladeofthegenusVibriobyusing16SrRNA,recA,pyrH,rpoD,gyrB,rctBandtoxRgenes[J].InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,2010,60:154.[19]ThompsonFL,BrunoGomez-Gil,AnaTeresaRibeiroVasconcelosetal..MultilocussequenceanalysisrevealsthatVibrioharveyiandV.campbelliiformdistinctspecies[J].Applied&EnvironmentalMicrobiology,2007,doi:10.1128/AEM.00020-07. [20]SerranoW,AmannR,RamonRossello´-Moraetal..Evaluationoftheuseofmultilocussequenceanalysis(MLSA)toresolvetaxonomicconflictswithinthegenus[J].Marichromatium.SystematicandAppliedMicrobiology,2010,33(3):116–121.[21]ShiraiH,NishibuchiM,RamamurthyTeta1..Polymerasechainreactionfordetectionofthecholeraenterotoxinoperonofvibriocholerae[J].JClinMicrobiol,1991,29:27-30.[22]RamamurthyT,PolA,BagPKeta1..Detectionofcholeratoxingeneinstoolspecimensbypolymerasechainreaction：comparisionwithbeadenzymelinkedimmunosorbentassayandculturemethodforlaboratorydiagnosisofcholera[J].JClinMierobiol,1993,31:3-6.[23]DziejmanM,BakonE,BoydDeta1..ComparativegenomicanalysisofVibriocholerae:cholerae:genesthatcorrelatewithcholeraendemicandpandemicdisease[J].ProcNatlAcadSciUSA,2002,3:166-181.[24]SweswarN,RanjankKN,SarmishtHMeta1..Rapidmethodforspecies—specificiden—tificationofVibriocholeraeusingprimemtargetedtothegeneofoutermembraneproteinompW[J].JClinMicro,2000,38:145-151.[25]GuoCL,WangT,PengQeta1..ThePhylotypeofThermusfromtheRehaiGeothermalArea,Tengchong,China[J].TheJoumalofMicrobiology,2003,41(2):152-156. 毕业论文文献综述生物工程弧菌分类鉴定的进展摘要：弧菌是一类水生环境中广泛存在的革兰氏阴性菌，是很多生物体的致病菌。随着分子生物学的发展，弧菌分类鉴定的方法越来越多，也越来越深入，本文通过对现有的弧菌的分类鉴定方法进行罗列总结并提出了弧菌分类鉴定方法的发展方向。关键字：弧菌；16SrRNA；MLSA；全基因组序列；序列分析；分类1弧菌简介弧菌是一类广泛分布于自然界，尤以水生为多的革兰氏阴性菌。弧菌科（Vibrionaseae）大多数为氧化酶阳性，有端鞭毛、动力阳性。弧菌属（Vibrio）分解葡萄糖，产酸不产气，对弧菌抑制剂O/129（二氨基二异丙基喋啶）敏感。由意大利人FilippoPacini发现第一种弧菌以来，至今已超过74种弧菌被发现[1]。某些弧菌是人及水产动物的致病菌。如副溶血性弧菌（VibrioParahaemolyticus）、河弧菌(VibrioFluvialis)等能引起食物中毒；鳗弧菌(VibrioAnguillarum)、鲑弧菌(VibrioSalmonicida)、哈维氏弧菌（VibrioHarveyi）等是某些水产养殖动物的病原菌；霍乱弧菌（VibrioCholerae）中的O1群古典生物型(ClassicalBiotype，CVC)、埃尔托生物型(ElTorBiotype，EVC)和O139群VC能引起慢性腹泻疾病或造成局域性流行[2]。霍乱弧菌的潜伏期一般1-2天，短的数小时，长的5-6天。霍乱弧菌干燥2h或加热55℃lOmin即死亡，煮沸立即死亡[3]。弧菌的致病过程包括黏附、侵袭、体内增殖及产生毒素等，这与弧菌产生的毒力因子有关。目前发现的弧菌毒力因子有外毒素(Exotoxin)、蛋白酶(Protease)、荚膜(Capsule)、载铁体(Siderophore)及外膜蛋白(OuterMembraneProtein，OMP)等[4]。某些海洋弧菌（如VibrioPacini）可产几丁质酶[5]，进而分解几丁质增加海洋中氨基糖的来源。还有的弧菌能产抗生素，降解多元环芳香烃以及为某些水生生物提供多不饱和脂肪酸。2弧菌的分类鉴定根据伯杰氏系统细菌学手册（第二版，2004年），弧菌属于γ-变形菌纲，弧菌科有8个属，弧菌属包括51个种。2003年，Thompson等通过16SrRNA序列和表型特征分析把弧菌分为3个科。2004年，Thompson等通过16SrRNA，recA与rpoA 基因序列分析把弧菌分为4个科（Salinivibrioaceae，Enterovibrioaceae，Photobacteriaceae，Vibrionaceae）[6]。其中Vibrionaceae只有一个含63种弧菌的弧菌属。微生物分类鉴定方法主要有4种：在表型特征水平上，通过观察微生物的形态特征、运动性、酶反应、营养要求、生长条件、代谢特性、致病性、抗原性和生态学特性等进行鉴定的方法；在细胞组分水平上，对细胞壁、脂类、醌类和光合色素等的鉴定；在蛋白质水平上，有氨基酸序列分析、凝胶电泳和各种免疫标记技术等；在核酸水平上，包括G+Cmol%值的测定，核酸分子杂交，16S或18SrRNA寡核苷酸序列分析，重要基因序列分析和全基因组测序等[7]。2.1表型特征分类鉴定目前主要使用增菌液和选择性培养基分离检测弧菌。根据巫结冰等人实验发现使用CV培养基（科玛嘉弧菌显色培养基）可同时对海(水)产品进行多种弧菌的检测[8]，另外也可以用无营养盐的海水双层琼脂平板法[9]及选择性培养基TCBS（硫代硫酸钠柠檬酸胆盐蔗糖培养基）进行检测[10][11]。2.2分子水平上的分类鉴定在对弧菌的分类鉴定上，可采用API20E和BiologGN等生理生化标准鉴定系统进行鉴定；也可采用DNA-DNA杂交(DNA-DNAHybridization,DDH)[12]，RFLP（RandomFragmentLengthPolymorphism)，微阵列技术（Microarray），长度多态性(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，AFLP)，基因外重复回文系列PCR（RepetitiveExtragenicPalindromePCR，rep-PCR）[13]，多位点酶电泳法(MultilocusEnzymeElectrophoresis，MLEE)，多位点序列分析（MultilocusSequenceTyping，MLST)，多重PCR（MultiplexPC）[14]等在分子水平上进行鉴定。DDH在弧菌分类学中只有当DNA-DNA的相似性高于80%时，才会被定义为相同的种，但是每次新实验都需要选择标准菌株。微阵列(Microarmy)是指将许多特定的寡核苷酸探针有规律地排列固定于支持物(如膜、硅片及玻片)上，然后与待测的标记样品按碱基配对原理进行杂交，再通过检测系统对其进行扫描，进行基因的高通量、大规模、平行化、集约化的信息处理和功能研究[15]。MLEE于19世纪80年代开始被应用于细菌分型，是根据一个基因一种酶的学说，编码酶的染色体结构基因的多态性也表现为酶的多态性，通过对酶分子量和电荷的变异情况，推算其对应的基因位点的多态性，并经过多个酶基因的位点的综合分析，获得细菌的基因型。MLST 是通过对管家基因直接进行测序比较对细菌进行分型，该法具有分辨率高、序列数据明确可靠、数据重复性好、结果便于实验室之间交流比较、数据库构建和管理方便等优点[16]。MLEE检测的是整个编码基因的活性，而MLST分析时往往只对某个基因的一部分进行测序分析。MLSA（MultilocusSequenceAnalysis）是在MLST基础上发展而来，通过对多个编码蛋白基因的测序鉴定弧菌。另外，用超级树（Supertree）的方法也具有极高的可信度。AFLP是在RAPD和RFLP基础上发展起来的，起初使用放射性物质标记的引物，现在多使用荧光标记的引物。通过对基因组DNA双酶切后的限制性片段进行选择性扩增，再对扩增片段电泳后形成的图谱进行比较，在基因组水平揭示细菌之间的多样性。AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记，具有覆盖面广、高保真性、高效性、高分辨率、DNA用量少、事先勿需知道序列任何信息、可在全基因组产生标记、标记的分离遵循孟德尔遗传规律等优点[17]。然而这种技术的普及性不是很好，仅限于世界上几个实验室在使用，而且实验室之间指纹带型的比较也是很困难的，成为一种通用的网上可用的电子分类学工具并不容易。rep-PCR主要用于扩增基因组中高度重复序列的中间序列，Wong和Lin比较了RAPD、rep-PCR与PFGE这三种方法，发现rep-PCR具有最高的分辨能力。然而，这项技术不仅只限于世界上几个实验室在使用，而且它也主要应用于对于VibrioAlginolyticus，VibrioCholerae，VibrioVulnificus等菌的鉴定。另外，利用16SrRNA只能对弧菌精确地鉴定至科与属的水平，需结合其他标志分子有hsp60，gyrB，recA，rpoA，rpoB，atpA，dnaJ，lux，toxR[18][19][20]等能更精确地鉴定出弧菌。因为弧菌科中16SrRNA的相似性高于97.6%，有些种之间的的相似性甚至达到100%。在霍乱弧菌PCR检测方面，CT、zot、ace、slt、tcp、hly[21][22][23]等不同毒素基因用于快速检测产毒素的霍乱弧菌；外膜蛋白基因ompW用以检测各种霍乱弧菌[24]。而郭春雷等人[25]对几株栖热菌属(Thermus)的菌株和该属一些有效发表种进行了基于16SrRNA的部分区段的二级结构比较分析，利用内环、内环与发卡环之间碱基对数目以及发卡环的碱基数目区分种间差异，证明16SrRNA二级结构可以用来区分种一级的分类单位。2002年，细菌菌种定义复评特别委员会（adhoccommitteeforre-evaluationofthespeciesdefinitioninbacteria）规定，至少要对其染色体上的五个基因进行分析才能将一株细菌划分至种的水平。总而言之，DDH，FAFLP，rep—PCR，MLSA等比传统的表型特征分析更可靠，但是并不能通过因特网建立使许多分类学家可用的信息。 3弧菌分类鉴定的发展方向在现有的对弧菌鉴定的方法上，还需要做出很大的努力以期更精确更方便更高效地鉴定弧菌。寻找新的用于精确鉴定弧菌个体间差异的标志分子是一个很重要的方面。而16SrRNA的高级结构的研究极有可能对弧菌的精确鉴定带来新的里程碑。另外，全基因组序列的测定必然会对弧菌的精确分类鉴定带来全新的认识。参考文献：[1]HoffmannM,BrownEW,FengPCetal..PCR-basedmethodfortargeting16S-23SrRNAintergenicspacerregionsamongVibriospecies[J].BMCMicrobiology,2010,10(1):90.[2]芮勇宇,许锐恒,阚飙等.霍乱弧菌主要毒力和管家基因序列分析[J].中国公共卫生,2006,22(1):31-33.[3]梁栋,黄秀琴.历史上危害严重的传染病病原体[J].生物学教学,2002,29(4):54-55.[4]吴后波,潘金培.病原弧菌的致病机理[J].水生生物学报,2003,27(4):422-426.[5]余长缨,韩宝芹,李静等.海洋弧菌几丁质酶的产酶条件及分离纯化研究[J].高技术通讯.2002,12(9):70-73.[6]ThompsonFL,ThompsonCC,DawyndtPetal..Phylogenyandmolecularidentificationofvibriosonthebasisofmultilocussequenceanalysis[J].Applied&EnvironmentalMicrobiology,2005,71(9):5107-5115.[7]周德庆.微生物学教程[M].第二版.北京:高等教育出版社,2002:355-356.[8]巫结冰,陈德云,胡伟宁等.弧菌显色培养基进行多种弧菌分离鉴定的研究[J].中国卫生检验杂志,2007,17(8):1451-1452.[9]谢群英,房文红,乔振国等.海水蛭弧菌分离纯化方法初步研究[J].海洋渔业,2006,18(3):211-216.[10]曹琛,黄金勇,李举鹏等.TCBS培养基在虾病防治监测中的应用[J].水产科学,2003,22(6):46-47.[11]杜明,张洁.TCBS琼脂平板在弧菌培养中的应用评估[J].医学检验进修杂志,1996,3(1):41.[12]焦振全,刘秀梅.细菌分类鉴定的分子生物学方法研究进展[J].国外医学：卫生学分册.1996,23(6):356-361.[13]金莉莉,董雪,王秋雨等.副溶血性弧菌重复序列-PCR分型研究[J].微生物学通报,2008,35(3):389-394.[14]杜联峰,杨泽,余妍等.霍乱弧菌多重PCR检测方法的建立及优化[J].现代预防医学,2010,37(1):101-102,114.[15]刘毅,韩金祥,黄海南等.膜微阵列技术的建立及检测细菌条件的优化[J].临床检验杂志,2003,21(4):221-223.[16]王洪敏,柯昌文,潘武滨等.2005年广东省临床分离猪链球菌的MLST分子分型研究[J].南方医科大学学报,2008,28(8):1438-1441,1445.[17]刘静.AFLP分子标记的发展及应用[J].山东农业科学,2010,5:10-14.[18]PascualJ,M.CarmenMacián,ArahalDRetal..MultilocussequenceanalysisofthecentralcladeofthegenusVibriobyusing16SrRNA,recA,pyrH,rpoD,gyrB,rctBandtoxRgenes[J].InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,2010,60:154.[19]ThompsonFL,BrunoGomez-Gil,AnaTeresaRibeiroVasconcelosetal..MultilocussequenceanalysisrevealsthatVibrioharveyiandV.campbelliiformdistinctspecies[J].Applied&EnvironmentalMicrobiology,2007,doi:10.1128/AEM.00020-07. [20]SerranoW,AmannR,RamonRossello´-Moraetal..Evaluationoftheuseofmultilocussequenceanalysis(MLSA)toresolvetaxonomicconflictswithinthegenus[J].Marichromatium.SystematicandAppliedMicrobiology,2010,33(3):116–121.[21]ShiraiH,NishibuchiM,RamamurthyTeta1..Polymerasechainreactionfordetectionofthecholeraenterotoxinoperonofvibriocholerae[J].JClinMicrobiol,1991,29:27-30.[22]RamamurthyT,PolA,BagPKeta1..Detectionofcholeratoxingeneinstoolspecimensbypolymerasechainreaction：comparisionwithbeadenzymelinkedimmunosorbentassayandculturemethodforlaboratorydiagnosisofcholera[J].JClinMierobiol,1993,31:3-6.[23]DziejmanM,BakonE,BoydDeta1..ComparativegenomicanalysisofVibriocholerae:cholerae:genesthatcorrelatewithcholeraendemicandpandemicdisease[J].ProcNatlAcadSciUSA,2002,3:166-181.[24]SweswarN,RanjankKN,SarmishtHMeta1..Rapidmethodforspecies—specificiden—tificationofVibriocholeraeusingprimemtargetedtothegeneofoutermembraneproteinompW[J].JClinMicro,2000,38:145-151.[25]GuoCL,WangT,PengQeta1..ThePhylotypeofThermusfromtheRehaiGeothermalArea,Tengchong,China[J].TheJoumalofMicrobiology,2003,41(2):152-156. 本科毕业设计（20__届）两株霍乱疑似弧菌的分子鉴别 目录摘要（Abstract）1引言11.1弧菌简介11.2霍乱弧菌简介11.3霍乱弧菌鉴别方法12材料与方法12.1材料12.1.1样品12.1.2主要试剂及其配制12.1.3主要仪器22.2方法32.2.1菌株的分离纯化32.2.2DNA提取32.2.316SrRNA基因PCR扩增测序32.2.416SrRNA基因系统发育分析42.2.5其他基因测序分析43结果和分析53.1弧菌的分离纯化53.216SrRNA基因序列分析53.3其他基因序列分析84讨论8致谢：9参考文献10附录11附录一16SrRNA的PCR扩增序列11 摘要：霍乱弧菌是海产品的主要致病菌株之一。具有致病性的菌种主要有O1群埃尔托型、古典型和O139群。本研究从象山港口采集水样和底泥样品作为实验材料，在弧菌的选择性培养基TCBS上进行分离纯化，分离得到7株弧菌。再进行16SrRNA基因的PCR扩增测序。接着构建系统发育树，鉴别出菌株NH87-21_和菌株4为霍乱弧菌。最后查阅相关文献，推测菌株NH87-21_和菌株4为O1群埃尔托型霍乱弧菌。通过本研究，初步鉴定出菌株NH87-21_和菌株4均为霍乱弧菌，同时确认了16SrRNA基因可以用于霍乱弧菌的分子鉴别。关键词：弧菌；霍乱弧菌；16SrRNA基因；系统发育分析Abstract：VibrioCholeraeisoneoftheprimarypathogenicstrainstomarineproducts.OnlyVibrioCholeraeO19,O1ElTorandclassicalbiotypesarepathogenic.Inthisstudy,watersamplesandbottomsedimentsamplescollectedfromtheXiangshanPortwerechoosedastheexperimentalmaterials.AndweislatedsevenstrainsinVibrioselectivemedium.Afterthat,16SrRNAgenePCRwasfollowedbythesequencing.ThanwebuitthePhylogeneticTreeandidentifiedstrainNH87-21_andstrain4asVibrioCholerae.Finally,weinferredthatstrainNH87-21_andstrain4wereVibrioCholeraeO1ElTorafterreferencetorelatedpapers.Inthisstudy,strainNH87-21_andstrain4wereidentifiedasVibrioCholerae,whileweconcludedthat16SrRNAgenecouldbeeffectivetothemolecularidentificationofVibrioCholerae.Keywords：Vibrio;VibrioCholerae;16SrRNAgene;phylogeneticanalysis 1引言1.1弧菌简介弧菌是一类广泛分布于自然界，尤以水生为多的革兰氏阴性菌。弧菌科（Vibrionaseae）大多数为氧化酶阳性，有端鞭毛、动力阳性。弧菌属（Vibrio）分解葡萄糖，产酸不产气，对弧菌抑制剂O/129（二氨基二异丙基喋啶）敏感。某些弧菌是人及水产动物的致病菌。如副溶血性弧菌（VibrioParahaemolyticus）、河弧菌(VibrioFluvialis)等能引起食物中毒；鳗弧菌(VibrioAnguillarum)、鲑弧菌(VibrioSalmonicida)、哈维氏弧菌（VibrioHarveyi）等是某些水产养殖动物的病原菌。1.2霍乱弧菌简介霍乱是一种由霍乱弧菌（VibrioCholerae）引起的急性肠道病。主要症状是腹泻、迅速脱水以及呕吐。弧菌的致病过程包括黏附、侵袭、体内增殖及产生毒素等，这与弧菌产生的毒力因子有关[1]。目前发现的弧菌毒力因子有外毒素(Exotoxin)、蛋白酶(Protease)、荚膜(Capsule)、载铁体(Siderophore)及外膜蛋白(OuterMembraneProtein，OMP)等。霍乱弧菌共有200多种血清型[2]，其中能引起霍乱的只有O1群古典生物型(ClassicalBiotype，CVC)、埃尔托生物型(ElTorBiotype，EVC)和O139群[3]。自17世纪以来，霍乱已经在世界上发生了七次大流行。前六次均是由O1群古典生物型引起。现在正处于开始于1961年以印度尼西亚苏拉威西岛为发源地的第七次大流行期间，由O1群埃尔托生物型引起。1992年印度首次发生了由O139群引起的霍乱大爆发[4]。1.3霍乱弧菌鉴别方法当前对霍乱弧菌进行分子分型的主要方法有主要多位点酶电泳法（MLEE）、核糖体分型（RT）、脉冲场凝胶电泳分型（PFGE）、扩增片段长度多态性（AFLP）和基于聚合酶链反应的随机扩增多态性（RAPD）、基因外重复序列-PCR（REP-PCR）、肠道细菌重复性基因内一致性序列-PCR(ERIC-PCR)、盒式-PCR[5]、低频限制性位点-PCR（IRS-PCR）、多基因位点分型技术（MLST）[6]等。16SrRNA基因通过PCR，加入特定引物测序再构建出系统发育树，以确定细菌的种类[7]。霍乱弧菌霍乱毒素A亚单位基因ctxA、小带联结毒素基因zot、辅助霍乱肠毒素基因ace、霍乱弧菌毒素共调菌毛基因tcpA、毒素表达调控蛋白基因toxR等毒素相关基因已经应用于霍乱弧菌分型分析[8]。Bisweswar等人通过PCR扩增显示，全部检样霍乱弧菌的外膜蛋白基因ompW阳性，98%为toxR阳性[9]。本文采用16SrRNA基因PCR扩增进而进行系统发育分析，构建系统发育树[10]，结合其他基因分析，确定出菌株种类。建立起霍乱弧菌分子鉴别的方法系统，为检测霍乱弧菌预防疾病提供技术依据。2材料与方法2.1材料2.1.1样品从象山港口采集水样和底泥样品用于弧菌的分离。2.1.2主要试剂及其配制（1）TCBS培养基：酵母膏5g，蛋白胨10g，蔗糖20g，硫代硫酸钠10g，柠檬酸钠10g，牛胆酸钠3g，牛胆汁粉5g，氯化钠10g，柠檬酸铁1g，溴麝香草酚蓝（2%溶液）20mL，草酚蓝（1%溶液）4mL，琼脂15g，调整pH7.0，高温高压灭菌后冷却，倒平板。5 （1）LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，调整PH7.0，高温高压灭菌后4℃保存；（2）10×TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl，1.00mmol/LEDTA，121℃灭菌20min后4℃保存；（4）RnaseA溶液：将RnaseA溶于10mol/LTris-Hcl(pH7.5)，15mmol/LNacl中，配成10mg/ml的溶液，100℃加热15分钟，冷却后用1.5mL离心管分装成小份保存于-20℃。（5）10%SDS：SDS10%，pH7.2，室温保存；（6）NaAC：5mol/l，高温高压灭菌，4℃保存；（7）CTAB/NaCl溶液：10%CTAB，0.7MNaCl。在80ml双蒸水中溶解4.1gNaCl，然后缓慢加入10gCTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，同时加热并搅拌，加热至65℃溶解，定容至100ml；（8）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）(体积比)，4℃避光短期保存；（9）氯仿/异戊醇（24:1）（体积比），4℃保存；（10）NaAC5mol/l高温高压灭菌，4℃保存；（11）TaqDNA聚合酶(5units.μL-1)、dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP均10mmol.L-1）、10×PCRBuffer均购自上海生工生物工程技术服务有限公司；（12）溶菌酶缓冲液：40mMEDTA，pH8.0；50mMTris-cl，pH8.0；10％(m/V）蔗糖，用0.22µm的过滤器过滤除菌，4℃保存。2.1.3主要仪器（1）BIO-RAD梯度PCR仪（PTC0100）（2）Eppendorf微量移液器（3）Eppendorfcentrifuge冷冻离心机（5415R）（4）Eppendorfcentrifuge离心机（5415D）（5）电泳仪（BG—Power600i），上海精宏实验设备有限公司产品（6）电子天平（AL104），梅特勒—托利多仪器有限公司产品（7）台式高速冷冻离心机（TGL—16M），长沙湘仪离心机仪器有限公司（8）紫外可见分析装置（9）电热恒温水槽(DK—8D型)，上海精宏实验设备有限公司产品（10）超低温冷冻冰箱（11）RXZ智能型人工气候箱，宁波江南仪器厂产品（12）水平摇床（13）XYJ—875净化工作台（GB6168—85），苏州市伟业空调净化有限公司产品（14）微电脑智能化控制新型电热恒温鼓风干燥箱（DHG—9123A），宁波江南仪器厂产品（15）手掌型离心机（LX—100）（16）Galanz微波炉（PTO23TP—KT），佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司（17）各种规格Tips、Tubes和培养皿等5 2.2方法2.2.1菌株的分离纯化　将水样和底泥样品经生理盐水按梯度稀释，接种至平板上，每个梯度做三个重复，用划线法接种在TCBS培养基倒的平板上，在培养箱中30℃培养两天，挑出单菌落接种在新的TCBS培养基上30℃培养。培养到得单菌落作为下一步的实验对象。2.2.2DNA提取（1）从平板上挑取单菌落至大试管LB液体培养基中，培养12h左右，取10ml培养液，10,000g离心2min；（2）加入2mlTE悬浮沉淀菌体，再加入100μl溶菌酶（50mg/ml）、10μlRnaseA(10mg/ml)，摇匀，37℃水浴30min；（3）加入120μl10%SDS和10μl蛋白酶K(20mg/ml)，混匀，60℃水浴30min-1h。注意观察粘稠度增加和破壁效果；（4）加入500μl5mol/LNaCl，320μlCTAB/NaCl，65℃水浴10min；（5）3ml酚氯仿(25:24:1)抽提一次；4℃，12,000g离心10min；（6）转移上清后用等体积氯仿异戊醇(24:1)抽提2-3次；4℃，12,000g离心10min；（7）加入1/10体积的(3mol/L)NaAC，0.6体积异丙醇（或1体积的无水乙醇）沉淀DNA；4℃，12,000g离心1min；（8）用70%的酒精洗少量多次，三次以上。第一次不用弄起DNA沉淀，第二次洗涤弄起DNA沉淀，混匀充分后洗涤。第三次重新洗涤，尽量减少DNA里面的盐分和其他杂质；（9）所得的沉淀DNA用50μl水溶解，加入50μl的5mol/l的NaCl溶液，充分混匀。加入0.6倍体积的异丙醇沉淀后重新70%酒精洗涤；（10）风干后，用50μl水溶解样品，-20℃保藏备用。2.2.316SrRNA基因PCR扩增测序选用细菌通用性引物对27f/1541r，扩增细菌16SrDNA的全序列，其中引物序列见表1。表1扩增不同16SrDNA片段所用引物列表Tab.1Primersfor16SrDNAamplification引物名称引物序列（5′-3′）扩增片段片段大小27FAGAPTTTGATCCTGGCTCAG16SrDNA全序列约1500bp1541RACGGCTACCTTGTTACGACT50μl的PCR反应体系组成为：10×buffer（含Mg2+）5μl正向及反向引物4μmol/LdNTP200μmol/LTaqDNA聚合酶1U模板DNA50ng补双蒸水至50μl。为获得较好的特异性产物，采用降落PCR对反应体系进行扩增。PCR反应程序：5 94℃，5min；94℃，1min；60℃，1min；降落梯度为0.5℃10个循环72℃，0.5min。94℃，1min；55℃，1min；18个循环72℃，0.5min；72℃，3min。PCR产物采用1.5%(w/v)琼脂糖凝胶（含有0.5μg/ml溴化乙锭）电泳进行检测，点样量为4-5μl。2.2.416SrRNA基因系统发育分析系统发育分析（phylogeneticanalysis）是根据同源性状的分歧评估物种间的进化关系[11]。在系统学分类的研究中，最常用的可视化表示进化关系的方法就是绘制系统发育进化树（Phylogenetictrees），用一种类似树状分支的图形来概括各种（类）生物之间的亲缘关系[12]。通过比较生物大分子序列差异的数值构建的系统树称为分子系统（molecularphylogenetictree）。构建系统树[13]具体步骤如下：（1）建立txt文档：从NCBI下载不同属种的16SrRNA基因fasta文件，将所需序列复制到记事本中。建树时，先将属内所有种的序列下载，还有科内其他属各选择一个或多个序列下载下来。（2）将下载的序列和已经得到的两株未知菌的序列并入到同一个txt文档中，并在MEGA4.1上进行比对修饰构建系统发育进化树。2.2.5其他基因测序分析因为弧菌科中16SrRNA基因的相似性高于97.6%，有些种之间的的相似性甚至达到100%。需要结合其他特异基因进一步分析。产毒素的霍乱弧菌可以对ctxA、zot、ace、tcpA、toxR[14,15]等毒素相关基因进行PCR测序与系统发育分析。文献中可参考的引物如下表2所示：表2扩增霍乱弧菌毒素相关基因引物列表Table2PrimersforVibriocholeraetoxinsrelatedgenes引物名称引物序列（5′-3′）目标基因扩增产物（bp）P1CGGGCAGATTCTAGACCTCCTGctxA564P2CGATGATCTTGGAGCATTCCCACP3TCGCTTAACGATGGCGCCTTTTzot947P4AACCCCGTTTCACTTCTACCCAP5TAAGCATGTGCTTATGATGGACACCCace289P6CGTGATGAATAAAGATACTCATAGGP7CACGATAAGAAAACCGGTCAAGAGtcpA451P8CGAAAGCACCTTCTTTCACGTTGP9CCTTCGATCCCCTAAGCAATACtoxR779P10AGGGTTAGCAACGATGCGTAAG5 针对霍乱弧菌产毒素相关基因ctxA、zot、ace、tcpA、toxR测序分析可结合参考文献[8]和本文中16SrRNA基因测序后的系统发育分析的方法进行。Bisweswar等人研究发现霍乱弧菌外膜蛋白基因ompW与是否产毒素无关，可用于所有的霍乱弧菌的检测。因此，本文认为，以上16SrRNA与产毒素相关基因结合检测尚无法得出结果的时候可以再对ompW基因进行检测。引物[16]为：OMP—l5'一GTGATTTAAAACTGGACGACTCA一3'OMP—25'一CGTTGTATCATTTTCATTTCTCAA一3'根据检出的序列作系统发育分析。具体的操作过程可结合参考文献[16]和本文中16SrRNA基因测序后的系统发育分析的方法进行。3结果和分析3.1弧菌的分离纯化通过TCBS培养基和普通细菌培养基多次划线分离培养，分离得到7株弧菌。各菌落形态相似，如图1所示，均呈圆形，直径2mm-3mm，边缘较圆整，呈土黄色、光滑、湿润、细颗粒状。因此，根据菌株形态无法区分鉴别弧菌的种类，需通过后续分子分析进一步区分。图1两株分离到的弧菌的菌落形态Fig.1Thecolonialmorphologyoftwoisolatedstrains3.216SrRNA基因序列分析挑取单菌落，提取菌落DNA，以此作为模板采用细菌通用引物27f/1492r进行细菌16SrRNA基因的PCR扩增，经凝胶电泳观察，确定得到的PCR产物片段大小正确（约1400-1500bp）、且无非特异性扩增杂带。PCR产物送上海生工进行测序，得到的序列如附录一所示。通过Mega4.1软件按照上述方法构建系统发育树如图2：5 图2基于16SrRNA序列的霍乱弧菌系统发育树Fig.2ThephylogenetictreeofVibrioCholeraebasedonthe16SrRNA根据Mega4.1分析结果显示（表2），霍乱弧菌自成一簇，与其它弧菌具有较远的亲缘关系。结合图2和表2分析，菌株NH87-21_和菌株4与已知霍乱弧菌Vibch200、Vibchol5、Vibch199、Vibchol7的16SrRNA基因相似性高达100%，两株菌株本身也100%相似。但与其它弧菌的相似度较低，均低于97%，由此判定所得两株弧菌为霍乱弧菌。在NCBI上分别输入Vibch200、Vibchol5、Vibch199、Vibchol7的序列号X74697、AE004096、X74694、AE004157(在NCBI上查Nucleotide显示已被AE003852代替)查询相关文献[17-19]可知这四株均是霍乱弧菌O1群埃尔托型。由此推测本实验对象菌株NH87-21_和菌株4均是霍乱弧菌O1群埃尔托型。5 表316SrRNA基因相似性Tab.3Thesimilaritycomparisionof16SrRNA7 3.3其他基因序列分析本实验已经通过16SrRNA基因PCR扩增测序，进而系统发育分析确认出菌株为霍乱弧菌。并根据相关文献推测出菌株NH87-21_和菌株4均为O1群埃尔托型，所以无需其他基因序列分析。若无法通过16SrRNA基因确认时，可以根据实际情况选择霍乱弧菌的毒素相关基因ctxA、zot、ace、tcpA、toxR等中的一种或者多种基因测序、系统发育分析确认其具体生态学地位；若是不产毒素霍乱弧菌，可以选择ompW基因测序、系统发育分析确认其具体生态学地位。4讨论本文通过弧菌的选择性培养基TCBS分离纯化，根据菌落特征挑选可疑菌株作为实验材料。以27F、1541R为引物，通过16SrRNA基因的PCR扩增，送交上海生工生物工程有限公司检测，获得序列。由NCBI网站上查得已知序列，进行系统发育分析。发现菌株NH87-21_和菌株4与霍乱弧菌Vibch200、Vibchol5、Vibch199、Vibchol7的16SrRNA基因相似性高达100%，两株菌株本身也100%相似，而与其它弧菌的相似性均低于97%，因此初步判定所得两株弧菌均为霍乱弧菌。再查询Vibch200、Vibchol5、Vibch199、Vibchol7的相应序列号X74697、AE004096、X74694、AE004157，查阅相关文献，推测出两个菌株均是霍乱弧菌O1群埃尔托型。本研究表明，霍乱弧菌与其它弧菌种之间16SrRNA基因的差异性比较明显。这与哈维氏弧菌显著不同，哈维氏弧菌的各个种间16SrRNA基因的相似性往往高于97%，甚至达到99%以上。这样区分哈维氏弧菌的各个种必须结合其它基因进行。而对于霍乱弧菌，从系统发育树上看，其16SrRNA基因自成一簇，与其它弧菌的交叉性较小，大部分可以通过16SrRNA基因直接进行鉴别。对于少数通过16SrRNA无法确认菌株所属种群时，经过查阅大量文献，可以选择霍乱弧菌的毒素相关基因ctxA、zot、ace、tcpA、toxR等中的一种或者多种分析确认。另外，霍乱弧菌外膜蛋白基因ompW与毒素无关，既可以用来鉴别产毒素菌株，也可以用来鉴别不产毒素菌株。但ompW基因的分析还不如前述毒素相关基因分析完善，而且比较费时、成本较高，还需要更多这方面的研究。所以对于不产毒素菌株可以选择外膜蛋白基因ompW分析。具体可见前文相关叙述。总之，在鉴别霍乱弧菌的种群上，优先使用16SrRNA基因作PCR扩增测序，再利用系统发育分析，能简单、快速地初步鉴定种群范围，甚至直接确认菌株所属种群。若还无法确认时，结合ctxA、zot、ace、tcpA、toxR或ompW基因的分析可精确确认菌株的生态学地位。2 参考文献[1]吴后波，潘金培.病原弧菌的致病机理[J].水生生物学报，2003，27（4）：422-426.[2]ChowdhuryN,AsakuraM,NeogiSB,etal..DevelopmentofsimpleandrapidPCR-fingerprintingmethodsforVibriocholeraeonthebasisofgeneticdiversityofthesuperintegron[J].JournalofAppliedMicrobiology,2010,109:304-312.[3]DanielPK,MichaelCM,GaryKS,etal..GenomicandPhenotypicDiversityofCoastalVibriocholeraeStrainIsLinkedtoEnvironmentalFactors.AppliedandEnvironmentMicrobiology,2007,73(11):3705-3714.[4]谢雯，李蕴铷.O139霍乱[J].中国临床医生，2006，34（3）：8-10.[5]周海健，阚飙.霍乱弧菌的分子分型方法[J].疾病监测，2008，23（4）：258-262.[6]江晓，任春华，胡超群.分子分型技术在弧菌研究中的应用进展[J].海洋科学进展，2010，28（4）：563-569.[7]刘文强，贾玉萍，赵宏坤.16SrRNA在细菌分类鉴定研究中的应用[J].动物医学进展，2006，27（11）：15-18.[8]井良义，陈锦英，王书梅，等.多重PCR检测霍乱弧菌的毒素相关基因[J].环境与健康杂志，2003，20（6）：361-363，371.[9]BisweswarN,RanjanKN,SarmishthaM,eta1..RapidMethodforSpecies—SpecificIdentificationofVibriocholeraeUsingprimersTargetedtotheGeneofOuterMembraneProteinompW[J].JournalofClinicalMicrobiology,2000,38(11):4145-4151.[10]张会敏，冯友军.一株野生细菌的16SrDNA序列分析与系统发育树的构建[J].生物信息学，2004，3（1）：1-4，18.[11]吕宝忠.分子进化树的构建[J].动物学研究.1993，l4（2）：186—193.[12]冯思玲.系统发育树构建方法研究[J].信息技术，2009，6：38-40，44.[13]刘琳，刘洋，刘红娟.基于16SrDNA的系统发育分析在微生物进化关系中的应用[J].生物学通报，2008，43（11）：4-6.[14]HemantKK,BibhutiBP,GuruPC.QuadruplexPCRforSimultaneousDetectionofSerotype,Biotype,ToxigenicPotential,andCentralRegulatingFactorofVibriocholerae[J].JournalofClinicalMicrobiology,2008,46(7):2399-2401.[15]VirginiaLM,RonaldKT,JohnJM.CholeraToxinTranscriptionalActivatorToxRisaTransmembraneDNABindingProtein[J].Cell,1987,48:271-279.[16]贺晓龙.海产品中霍乱弧菌的分离及分子鉴定[J].青海大学学报（自然科学版），2009，27（3）：67-69.[17]RuimyR,BreittmayerB,ElbazeP,etal..PhylogeneticanalysisandassessmentofthegeneraVibrio,Photobacterium,Aeromonas,andPlesiomonasdeducedfromsmall-subunitrRNAsequences[J].InternationalJournalofSystematicBacteriology,1994,44(3):416-426.[18]JenniferJW,SethNK,SeánGB,etal..Onenutritionalsymbiosisbegatanother:PhylogeneticevidencethattheanttribeCamponotiniacquiredBiochmanniabytendingsap-feedinginsects[J].BMCEvolutionaryBiology,2009,doi:10.1186/1471-2148-9-292.[19]HeidelbergJF,EisenJA,NelsonWC,etal..DNAsequenceofbothchromosomesofthecholerapathogenVibriocholerae[J].Nature,2003,406:477-483.2 附录附录一16SrRNA的PCR扩增序列>NH87-21_AGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTACCGGATATGCCCAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAGGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGTAGGGAGGAAGGTGGTTAAGTTAATACCTTAATCATTTGACGTTACCTACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAAGCCCTGGGCTCAACCTAGGAATCGCATTTGAAACTGACAAGCTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAGATACTGACACTCA>004AGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTGGGAAATTGCCCGGTAGAGGGGGATAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGCATAACCTCGCAAGAGCAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTACCGGATATGCCCAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAGGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGTAGGGAGGAAGGTGGTTAAGTTAATACCTTAATCATTTGACGTTACCTACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAAGCCCTGGGCTCAACCTAGGAATCGCATTTGAAACTGACAAGCTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAA2