两株弧菌的分子鉴定【开题报告】

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1、毕业论文开题报告生物技术两株弧菌的分子鉴定一、选题的背景与意义弧菌在自然环境中分布广泛，生境多样。从淡水到混水，再到海水，尤其是有机质丰富的海淡水汇合的港湾。温度、盐度、有机营养等受潮汐、暴雨的影响波动很大，对弧菌的冲击也很大。同时弧菌既能游离生活，又能与其他生物附生或共生，有些还是人类和/或养殖动物的条件致病菌。弧菌的水生生态学研究表明，水生环境对弧菌的时空分布及相关疾病的爆发都起着非常重要的作用。核糖体是细菌唯一的细胞器，其16SrRNA在进化中高度保守，被称为细菌的“分子化石”，常用于细菌的鉴定与分类研究。1977年，C.Weose等在分析原核生物16SrRNA和真

2、核生物18SrRNA序列的基础上，提出了可将自然界的生命分为细菌、古菌和真核生物三域（domain），揭示了各生物之间的系统发育关系，为弧菌分类与鉴定提供了理论和实践基础。16SrRNA基因序列包含10个可变区(variableregion)和11个恒定区(constantregion)，可变区因细菌而异，变异程度与细菌的系统发育密切相关。在生物进化的漫长过程中，其基因序列的变化非常缓慢，因此可以用来标记生物的进化距离和亲缘关系。迄今为止已有许多弧菌的的全序列16SrRNA基因得以破译并免费公布，十分方便进行类似序列的比较分析。随着研究的深入，逐渐建立了以16SrRNA基

3、因为分类标准的各大数据库例如：GeneBenk、EMBL等。这些数据库为广大的分类及分子研究的科研院所以及学者提供了强大的数据支持。本研究采用一对弧菌16SrRNA基因引物通用PCR扩增两株未知弧菌的部分16SrRNA基因，对基因扩增片段做进一步的序列测定，通过序列同源性分析显示，从而确定该弧菌的分类学地位。该方法是一种十分方便有效的弧菌鉴定方法，可在实践中加以推广应用。通过此项课题为进一步探究16SrRNA基因在弧菌鉴定上发挥的作用和寻找防治致病弧菌的新方法提供理论依据。同时为研究弧菌群落演替提供技术支撑，为揭示弧菌的生态学和流行病学规律具有重要意义。二、研究的基本内容

4、与拟解决的主要问题：研究的基本内容：本实验主要是对采样获取的两株弧菌中提取其总DNA，获得该两株菌的16SrRNA基因，并进行分子鉴定与序列分析及进化树构建。拟解决的问题：16SrRNA基因与其他高分辨基因(如recA基因等)相结合进行对弧菌进行鉴定和系统发育树分析。三、研究的方法与技术路线：（一）研究方法1.实验材料本实验材料为从环境样品中提取出的两株弧菌，进分离纯化后接种到培养皿培养备用。2.形态学特征和生理生化鉴定菌落大小、表面形态、边缘、质地和光泽等特征进行初步鉴定。3.总DNA提取1、大试管液体扩繁，收集10ml培养液，离心；2、加入2mlTE悬浮菌体，溶菌酶1

5、00ul（50mg/ml）、RnaseA10ul(10mg/ml)，摇匀；水浴30min3、加入120ul10%SDS和蛋白酶K(20mg/ml)10ul60℃水浴30min—1h4、加入500ul5mol/LNaCl，320ulCTAB/NaCl，65℃水浴10min5、3ml酚氯仿(25:24:1)抽提一次（一定要混匀）6、转移上清后用等体积氯仿异戊醇(24:1)抽提1次7、加入1/10体积的(3mol/L)NaAC，0.6体积异丙醇沉淀DNA8、用70%的酒精洗少量多次，三次以上。第一次不用弄起DNA沉淀，第二次洗涤弄起DNA沉淀，混匀充分后洗涤。第三次重新洗涤，尽

6、量减少DNA里面的盐分和其他杂质。9、所得的沉淀DNA用50ul水溶解，加入50ul的5mol/l的NaCl溶液，充分混匀。加入0.6倍体积的异丙醇沉淀后重新70%酒精洗涤。风干后，用25ul水溶解样品。10、风干后，用50ul水溶解样品，-20℃保藏。4PCR方法测定获取目的基因序列16SrRNA基因PCR扩增设计两个引物。在20tA反应体系中含有：无菌蒸馏水14.4μL，1×PCR缓冲液2μL，1.5mmol/LMgCl21.6μL，4×dNTP混合物0.4μL，引物各0.2μL，2.5U/μL的TaqDNA聚合酶0.2μL，模板DNA1μL。PCR反应条件为：95℃

7、预变性3min、接94℃变性lmin、55℃复性1min和72℃延伸2min，30个循环后72℃温育6min。5.随机测序及序列分析琼脂糖凝胶检测PCR产物，预期大小的扩增条带回收后克隆至pMD19-T载体，对序列进行序列测定。序列测定和分析采用ABIPRISMTM3770DNA自动测序仪双向测序，由上海华大公司测定。序列分析采用BLASTP分析软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，多重序列比对采用DDBJ软件ClustalW程序(http://clustalw.ddbj.nig.ac.