两株霍乱疑似弧菌的分子鉴别【开题报告】

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1、毕业论文开题报告生物工程两株霍乱疑似弧菌的分子鉴别一、选题的背景与意义霍乱是由霍乱弧菌所致的烈怀肠道传染病。主要症状是腹泻、迅速脱水以及呕吐。弧菌的致病过程包括黏附、侵袭、体内增殖及产生毒素等，这与弧菌产生的毒力因子有关。目前发现的弧菌毒力因子有外毒素(Exotoxin)、蛋白酶(Protease)、荚膜(Capsule)、载铁体(Siderophore)及外膜蛋白(OuterMembraneProtein，OMP)等。霍乱弧菌（VibrioCholerae）中的O1群古典生物型(ClassicalBiotype，CVC)、埃尔托生物

2、型(ElTorBiotype，EVC)和O139群霍乱弧菌能引起慢性腹泻疾病或造成局域性流行。主要通过饮水、食物和日常生活接触传播。如果不当食用已感染的水产品容易致病。霍乱弧菌的潜伏期一般1-2天，短的数小时，长的5-6天。霍乱弧菌干燥2h或加热55℃l0min即死亡，煮沸立即死亡。可以使用选择性培养基TCBS（硫代硫酸钠柠檬酸胆盐蔗糖培养基）对霍乱弧菌进行分离纯化。PCR扩增弧菌16SrDNA，并结合CT、zot、ace、slt、tcp、hly等不同毒素基因，外膜蛋白基因ompW，管家基因dnaE、hlyA、mdh、recA等进行测

3、序及序列分析。通过本试验，促进霍乱弧菌分类鉴定方法的完善，建立起霍乱弧菌分子鉴别的方法系统，为检测霍乱弧菌预防疾病提供技术依据。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题：（一）研究的基本内容通过16SrRNA基因以及其他基因序列比较分析，分离鉴定两株养殖塘霍乱弧菌，建立起霍乱弧菌分子鉴别的方法系统，促进霍乱弧菌分类鉴定方法的完善，为检测霍乱弧菌预防疾病提供技术依据。（二）拟解决的主要问题分离鉴定两株霍乱弧菌，建立霍乱弧菌分子鉴别的方法系统。三、研究的方法与技术路线：（一）研究的方法1.菌落分群采集样品，在选择性培养基上进行分离纯化。2.菌

4、株形态特征分析对经纯化的菌株进行生理生化分析。3.弧菌DNA的提取3.1试剂溶菌酶缓冲液：40mMEDTA，pH8.050mMTris-cl，pH8.010％(m/V）蔗糖用0.22µm的过滤器过滤除菌，4℃保存。STE缓冲液：10mMEDTA，pH8.025mMTris-Cl，pH8.050mM葡萄糖121℃灭菌20min，4℃保存。1×工作液，pH8.0：1mMEDTA，pH8.010mMTris-Cl，pH8.0TE缓冲液：100mMTris-Cl，pH8.010mMEDTA，pH8.010×贮存液，pH8.0分装后121℃灭菌

5、20min，室温保存。3.2SDS-煮沸法提取DNA①向M1管中加入5mlSTE缓冲液，在漩涡混合器上进行充分振荡；②加1/10体积的20％的SDS溶液(约500μl），混匀后，用沸水浴2.5min，将裂解液转移至新的无菌离心管中，-20℃，10min；③室温离心，10000rpm，10min，弃去上清液；④用600μl的1×TE缓冲液溶解沉淀，然后将溶液转移至1.5mlEppendorf管中；⑤加等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液(25:24:1，v/v），用手轻轻混匀。离心，10000rpm，4min；⑥收集上清液，然后再加入等体积的氯

6、仿/异戊醇溶液(24:1，v/v）混匀，离心，10000rpm，4mi①收集上清液，然后加入1/10体积的3M的醋酸钠和2倍体积的无水乙醇，混匀，室温沉淀10min，离心，10000rpm，10min；②用70％乙醇洗涤，然后再次离心，弃去上清液，自然风干，加1×TE溶液或无菌双蒸水溶解DNA，置于-20℃保存；4.16SrDNAPCR扩增测序选用细菌通用性引物对27f/1541r，扩增细菌16SrDNA的全序列，其中引物序列见表1。表1扩增不同16SrDNA片段所用引物列表Tab.1Primersfor16SrDNAamplific

7、ation引物名称引物序列（5′～3′）扩增片段片段大小27FAGAPTTTGATCCTGGCTCAG16SrDNA全序列约1500bp1541RACGGCTACCTTGTTACGACT50μl的PCR反应体系组成为：10×buffer（含Mg2+）5μl正向及反向引物4μmol/LdNTP200μmol/LTaqDNA聚合酶1U模板DNA50ng补双蒸水至50μl。为获得较好的特异性产物，采用降落PCR对反应体系进行扩增。PCR反应程序（适用于引物对GC+341F和518R）：94℃，5min；94℃，1min，60℃，1min，降

8、落梯度为0.5℃10个循环72℃，0.5min；94℃，1min，55℃，1min，18个循环72℃，0.5min；72℃，3min。PCR产物采用1.5％(w/v)琼脂糖凝胶（含有0.5μg/ml溴化乙锭）电泳进行检测