NBT法测定SOD活力

《NBT法测定SOD活力》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、NBT法测定SOD活力1.原理超氧化物岐化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基（O2.-）的酶，它催化下列反应：2O2.-+2H+→H2O2+O2反应产物H2O2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。实验中依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2.-，O2.-可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2.-，从

2、而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可计算出酶活性大小。2.试剂50mM，PH7.8磷酸缓冲液（57.1875mLA+5.3125mLB定容至250mL）130mM甲硫氨酸，0.1940g→10mL，磷酸缓冲液配制750µMNBT，0.0061g→10mL，磷酸缓冲液配制100µMEDTA-Na2，0.0037g→100mL，磷酸缓冲液配制20µM核黄素，0.00753g→100mL，蒸馏水配制，避光保存附录：不同pH磷酸缓冲液的配制母液：A：0.2MNa2HPO4溶液：Na2

3、HPO4.12H2O71.64g用蒸馏水溶至1LB：0.2MNaH2PO4溶液：NaH2PO4.2H2O15.60g用蒸馏水溶至500mL100mM磷酸缓冲液配法：x(mL)A+y(mL)B稀释至200mLpH5.86.06.56.87.07.57.67.77.87.98.0x(mL)A8.012.331.549.061.084.087.089.591.593.094.7y(mL)B92.087.768.551.039.016.013.010.58.57.05.3实验步骤（1）酶液粗提称取一定量的实验材料于预冷的研钵中，加入适量磷

4、酸缓冲液，冰浴充分研磨后定容（1mL/0.1g）。取1.5mL匀浆于4℃,10000rpm离心15min，上清液即为酶粗提液。（POD，CAT，MDA，可溶性蛋白等的测定均按此方法提取）（2）反应液配制取透明度好的指形管或离心管，按下表依次加入各溶液：试剂（酶液）用量/µL终浓度/比色时50mM磷酸缓冲液600130mMMet12013mM750µMNBT12075µM100µMEDTA-Na212010µM20µM核黄素1202.0µM酶液20对照以缓冲液代替酶液蒸馏水100总体积1200混匀后将1只对照管放在暗处，其它各样品于

5、4000lx日光下反应20min（各管受光必须一致，温度高则缩短时间，低则延长）。（3）SOD活性测定与计算反应结束后，以不照光的对照管作空白，分别测定560nm波长下的吸光值。以SOD抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位，按下式计算SOD活性：SOD总活性=[(Ack-AE)×V]/[0.5×Ack×W×Vt]SOD比活力=SOD总活力/蛋白质含量式中：SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力以酶单位/mg蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光值；AE为样品管的吸光值；V为样品液总体积，mL；Vt为测定时样品用量，mL；W为样

6、品鲜重，g；蛋白质含量单位为mg蛋白/g鲜重