4氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)活力.doc

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1、个人收集整理仅供参考学习氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出

2、酶活性大小。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：植物叶片。（二）仪器设备：高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，荧光灯（反应试管处照度为4000lx），试管或指形管数支，黑色硬纸套。（三）试剂（1）0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。[0.2M的Na2HPO491.5mL和NaH2PO48.5mL混合后稀释4倍]or[0.05mol/LPBS缓冲液（pH7.8）：7.1g/L，6.8g/LKH2PO4，按体积9:1混合，如pH高或低于7.8，则用KH2PO4或Na2HPO4调节。每1000mL缓冲液含8gNaCl，0.2gKCl]提取介质：内含1%聚乙烯吡咯烷酮的上述缓冲液。

3、（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。（3）750µmol/L氮蓝四唑溶液（NBT）：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。（4）100µmol/LEDTA-Na2溶液：称取0.03721gEDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至1000ml。（5）20µmol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存，现用现配。三、实验步骤1.酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于研钵中液氮研磨成粉末，加2ml预冷的提取介质在冰浴上研磨成浆，加入提取介质冲洗研钵

4、，提取介质终体积为5ml。取1.5-2ml于4℃下10000r/min下离心20min，上清液即为SOD粗提液。2.显色反应取5ml指形管或试管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下表加入各种溶液：[当样品数量较大时，可在临用前根据用量将表中各试剂（酶和核黄素除外）按比例混合后每支试管一次加入2.65mL，然后依次加入核黄素和酶液，但终浓度不变。]试剂名称用量（mL）终浓度（比色时）0.05mol/L磷酸缓冲液1.5130mmol/LMet溶液0.313mmol/L750µmol/LNBT溶液0.375µmol/L100µmol/LEDTA-Na2溶液0.310µmo

5、l/L20µmol/L核黄素溶液0.32.0µmol/L酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管罩上比试管稍长的双层黑色硬纸套遮光或个人收集整理仅供参考学习置暗处，其他各管于4000lx日光下反应10min（要求各管受光情况一致，反应温度控制在25～35℃之间，温度高时间缩短，低时延长；视酶活性高低可适当调整反应时间）。3.SOD活性测定至反应结束后，用黑布罩盖上试管，以不照光的对照管作空白，分别测定其他各管在560nm下的吸光度。四、结果计算已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。式中：SOD

6、——活性以每克鲜重酶单位表示，比活力以每毫克蛋白酶单位表示；A0——照光对照管的吸光值；As——样品管的吸光值；Vt——样液总体积（mL）；VS——测定时样品用量（mL）；W——样品鲜重（g）；蛋白质浓度——每克鲜重含蛋白毫克数（mg·g-1）。五、注意事项1.核黄素产生O2-，NBT还原为蓝色的化合物都与光密切相关，因此，测定时要严格控制光照的强度和时间。2.植物中的酚类对测定有干扰，制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP），尽可能除去植物组织中的酚类等次生代谢物质。3.测定SOD活性时加入的酶量，以能抑制反应的50％为佳。