猪血液中超氧化物歧化酶（SOD）的提取及活力测定.doc

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1、猪血液中超氧化物歧化酶（SOD）的提取及活力测定学校青岛农业大学学院生命科学学院年级专业生物技术1001姓名毛嘉宁（18765901704）王颖（18765905095）摘要哺乳类动物血液中存在着大量的生物活性物质,如超氧化歧化酶(Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ,简称ＳＯＤ)、凝血酶等。是生物体内重要的超氧阴离子自由基清除剂，能催化生物体内超氧自由基（O2-）歧化反应，对机体细胞起保护作用，己成为化学及生物化学研究领域中热门的研究课题。ＳＯＤ在临床上有广泛用途(延缓人体衰老、防止色素沉着、消除局部炎症等),特别是治

2、疗风湿性关节炎、慢性多发性关节炎及放射治疗后的炎症。在实验中利用血块采用机械破碎法破膜，采用热变性和乙醇—氯仿沉淀去除杂蛋白，然后用丙酮沉淀得到粗SOD溶液。关键词：超氧化物歧化酶分离提取猪血1前言体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内。现已证实，在生物体内，SOD具有抗氧化、解毒等重要作用；在体外，具有抗辐射、抗肿瘤及抗衰老、增强人体免疫等功能，广泛用于医药、食品、化妆品等行业，市场广阔。猪血是SOD的重要来源，我国猪血资源十分丰富，具有独特的加工优势。本实验在加热法的基础上用有机溶剂丙酮沉淀超氧化物歧化酶SOD，将SO

3、D从血液中提取出来。2实验目的：2.1了解SOD的生理功能2.2了解SOD的制备方法3实验原理：超氧化物歧化酶(SOD)是一种金属酶，也是一种蛋白质，可在一定浓度的酸、碱、盐溶液中溶解，又可在一定浓度的有机溶剂中沉淀，可以利用这一特点，将SOD从血液中提取出来。3.1加入柠檬酸三钠作为抗凝血剂使用，通过离心机离心，从猪血中分离出红细胞。3.2利用95%乙醇洗掉DNA，利用氯仿抽提血红蛋白等杂蛋白，再通过离心作用进行离心分离。43.3利用热变性原理，在随温度的升高和实验操作时间的延长，酶的活性和杂蛋白的含量均呈下降趋势，从比活性

4、上讲猪血中的SOD在55℃-65℃变性。变性时间为15—26min最适宜，酶纯度最高。3.4利丙酮作为有机溶剂除杂，离心去沉淀。3.5在一般情况下，SOD酶活性测定只能应用间接活性测定法。邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出02-，生成带色的中间产物，反应开始后先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30-45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长处有强烈光吸收。当有SO

5、D存在时，由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过计算即可求出SOD的酶活性。酶活力单位定义：在25℃恒温条件下，每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。4实验设备4.1恒温水浴冰浴器4.2离心机4.3布氏漏斗、抽滤瓶、滤纸4.4烧杯、量筒、玻璃棒5实验材料及试剂5.1猪血5.23.8%（质量分数）柠檬酸三钠5.30.9%（质量分数）氯化钠5.495%（体积分数）乙醇5.5氯仿5.6丙酮5.7pH7.6、2.5mmol/LK2HPO4-KH2PO4

6、缓冲液5.8去离子水、蒸馏水5.9pH8.2、50mmol/LTris-HCla.称取Tris0.61g，EDTA-2Na0.037g,用双蒸馏水溶解至80ml左右，用HCl调节pH=8.20（用pH计校正），最后定容至100mL。45.1010mmol/LHCl5.1150mmol/L邻苯三酚a．称取邻苯三酚0.063g，用10mmol/LHCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。6实验操作步骤6.1分离血球取新鲜猪血，加入到3.8%柠檬酸三钠抗凝液中，新鲜猪血与抗凝液的比例为3：1，轻轻搅拌均匀，4000r/min离心20

7、min，收集红血球。6.2除血红蛋白红血球用3倍体积生理盐水洗涤，4000r/min离心20min，重复三次，然后向洗净的红血球加入1～1.1倍体积去离子水，搅拌溶血30min，再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，静置1h，然后4000r/min离心20min除去变性血红蛋白沉淀，取清液，过滤，收集滤液。6.3热变性上清液加热到65℃，保温10min，然后迅速冷却到室温，3000r/min离心20min，弃去沉淀物，收集上清液。6.4沉淀清液在盐冰浴中冷却，

8、然后在-5℃以下的操作温度下，加入1.5倍量预冷丙酮，边加边搅拌均匀，快搅慢加，即有白色沉淀产生，用4000r/min离心20min，用pH7.6的2.5mmol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲液透析，即得粗SOD溶液。6.5邻苯三酚自氧化速率的测定取两支试管按下表加入25