猪血中超氧化物歧化酶(SOD)分离纯化及活力测定

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1、实验二猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活力测定一、原理超氧化物岐化酶SOD广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。     SOD是一种酸性蛋白，对热、pH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。根据金属辅基的不同，它可以分为四类，分别为Mn-SOD、Cu-Zn-SOD、Fe-SOD、Ni-SOD，其中最常见CuZn-SOD，主要存在于真核细胞的细胞质中。CuZn-S0D酶蛋白的分子量约为3.2×104，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体，每个亚基(

2、肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。SOD作为机体内最重要的抗氧化酶体之一，可以直接清除过量的超氧自由基，阻止机体的过氧化，对机体有较高的防护作用及保健价值。 本实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定。酶活性单位定义为:在1ml的反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定义为一个活力单位。二、试剂与器材1、试剂：ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿、考马斯亮蓝G-250、50mmol/LpH8.3磷酸缓冲液、10mmol/LEDTA钠盐溶液、3mmol/L邻苯三酚溶液等。2、器材：752分光光度计、分析天平、具塞试管、刻度吸管、离心机、烧杯、电

3、泳装置、微量进样器、注射器等。三、操作步骤1.SOD提取 取新鲜猪血20ml，加入到檬酸三钠抗凝液中，新鲜猪血与抗凝液的比例为0.15：1，轻轻搅拌均匀，4000r/min离心10min，收集红血球。然后用2倍体积生理盐水洗涤，4000r/min离心10min，弃上清液；重复2次，得洗净的血红球浓稠液。 然后向洗净的红血球加入等倍体积去蒸馏水，搅拌溶血30min，再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，4000r/min离心10min，除去变性蛋白沉淀，取清液0.5mL。过滤，收集滤液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度），上清液

4、加热到65℃-70℃，保温15min，然后迅速冷却到室温，4000r/min离心5min，弃去沉淀物，收集上清液（样品2记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。 粗酶液中加入等量预冷丙酮，边加边搅拌均匀，冰箱中静置1h，然后4000r/min离心10min，弃去滤液得沉淀。讲沉淀用丙酮洗两次，离心收集沉淀，自然干燥得绿色成品，称重。按1mg/1mL溶于蒸馏水，备用。 2、SOD酶活性测定 (1)邻苯三酚自氧化速率的测定。 取两支试管加入25℃预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/LHCl代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔

5、30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化。要求自氧化速率控制在每分钟的吸光值变化在0.07左右。 (2)酶活力测定 样品管取代自氧化管。样品管测定时先加入预热的待测酶液，再加邻苯三酚。其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定。 (3)酶活性单位的计算 根据酶活性单位的定义，按照下列公式计算酶活性：单位活性(u/ml)=×反应液总体积数×其中Ao为邻苯三酚自氧化率；Am为加酶后的邻苯三酚自氧率 总活性（U）=单位活性×酶原液总体积 (4)蛋白质浓度测定（考马斯亮蓝G-250法）A标准曲线制作试剂试管123456蛋白标准液（ml）00.20.40.60.81蒸馏水（ml）10.80.60.

6、40.20考马斯亮蓝（ml）555555蛋白质含量（ug）020406080100盖上塞子，摇匀。在595nm下闭塞测定光密度值，1h内完成。以牛血清蛋白（ug）为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。 B样品中蛋白质含量测定 将待测的SOD溶解并稀释到一定浓度，取一支具塞试管，加入0.1mL样品提取液，加入0.9mL蒸馏水和5mL考马斯亮蓝试剂，其余操作同上。 C蛋白质含量计算根据所测样品提取液的光密度，在标准曲线上查的相应的蛋白质含量，计算其浓度。（5）结果处理 利用考马斯亮蓝法测定每毫升酶原液蛋白质毫克数。计算公式为： 比活力（U/mg）=每毫升酶液活性单位（U/ml）/每毫升酶液蛋

7、白浓度（mg/ml） 将测得的数据或计算结果填入下表提纯步骤酶液总体积（mL）蛋白质（mg/mL）酶活性U/mL总活性U比活性U/mg回收率%纯化倍数除血蛋白上清热变性后上清丙酮沉淀四、实验结果1、[1]邻苯三酚自氧化速率=（0.092+0.078+0.086+0.079）/4=0.083/min。分别计算加入样品1后邻苯三酚自氧化率：0.054/min0.062/min0.059/min0.065/min0.060/m