猪血中超氧化物歧化酶(sod)的分离纯化及活力测定、同工酶电泳

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1、一、原理1.超氧化物歧化酶（SOD）超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）是一种能专一地清除超氧离子自由基（O2-）的金属酶，它具有抗衰老、抗辐射、抗炎及抗癌等作用因而在医药、化妆品及食品工业等方面有了广泛的应用前景。SOD是一种酸性蛋白，对热、pH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。按照它所含金属离子的不同，可分为Cu-Zn-SOD（二聚体，蓝绿色）、Mn-SOD（紫红色）和Fe-SOD（黄褐色）三种。SOD催化下述反应：2H++2O2-→H2O2+O2。机体内O2-的过量和不足均对机体不利，SOD对过量的O2-的及时清除保证了机

2、体内O2-的含量相对的平衡。机体内的O2-形成可分为生理性和病理性两方面。在一些正常生理过程中会形成一些O2-。例如：呼吸链中电子传递结果可产生一些O2-。在某些疾病（如氩中毒、辐射病等）过程中会产生大量的O2-。过量的O2-如不及时清除，会对细胞损伤。SOD将O2-歧化为H2O2和O2，而过氧化氢（物）酶、谷胱甘肽过氧化酶可催化或氧化氢分解，在机体内形成一套解毒系统，对机体起防护作用。2.有机溶剂沉淀法分离纯化蛋白质本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行分离纯化。有机溶剂沉淀法的基本原理：①亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质

3、的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀；②水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。常见的有机溶剂有丙酮和乙醇等。3.邻苯三酚自氧化法测定酶活力酶活性测定的方法有以下几种方法：邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法及亚硝酸法等。本实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为1个酶单位。邻苯三酚自氧化法的原理：利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自

4、氧化，产生O2-，生成有颜色的中间产物。反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，吸光度值与反应时间能在3～4min内维持线性关系。加入酶液则抑制自氧化的速率，在325nm波长处测定吸光度值即可。4.蛋白质含量测定样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮蓝G-250（CoomassicbrilliantblueG-250）在游离状态下呈红色，与蛋白质结合后呈现蓝色。在一定范围内，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，测定范围在1～1000μg。5.SOD同工酶分离鉴定SOD同工酶鉴定采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电

5、泳技术分离鉴定。用“负”显色法，核黄素（FAD）经光照所产生的O2-（氧自由基）能使氯化硝基四氮蓝（NBT）有黄色的氧化型转化为蓝色的还原型。由于SOD能够抑制O2-的作用，因此，电泳分离SOD后，凝胶上无SOD出应显示为蓝色，而有SOD处则无色透明，由此可鉴定SOD同工酶的酶谱（即同工酶的种类数量、分子量大小分布及活性大小）。二、操作步骤1.SOD的提取[1]取新鲜猪血20ml于50ml离心管，6000r/min，10min离心，去上层血浆，取下层红血球粘稠液，然后加入2倍体积的0.9%NaCl溶液清洗，6000r/min，10min离心，弃上层清

6、液，再加入2倍体积的0.9%NaCl溶液重复清洗一次，6000r/min，10min离心，得洗净的红血球粘稠液。[2]向洗净的红血球中加入等体积的蒸馏水，剧烈搅拌30min，使其充分溶血。再向溶血液中缓慢加入预冷的0.25倍体积的95%乙醇溶液和0.15倍体积的氯仿，匀浆呈暗红色，再继续搅拌15min，4000r/min，10min离心，去变性蛋白沉淀物，得上层液，留样500ul（样1）。然后将清液在65-70℃恒温水浴中进行热处理，15min后取出迅速冷却到室温，4000r/min，5min离心除去沉淀，得浅黄色粗酶液，留样500ul（样2）。[3

7、]向粗酶液中加入等体积的丙酮溶液，冰箱静置过夜，6000r/min，10min弃上清液，得沉淀。将沉淀物用等体积预冷的丙酮溶液清洗两次，离心收集沉淀，自然干燥即得淡绿色成品，溶于3ml蒸馏水，备用（样3）。1.SOD活力测定[1]邻苯三酚自氧化率的测定取4.5ml50mmol/LpH8.3的磷酸缓冲液，4.2ml蒸馏水和1ml10mmol/LEDTA-Na2溶液，混匀后在25℃水浴保温20min，取出后立即加入25℃预热过的邻苯三酚溶液0.3ml，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，用10mmol/LHCl作空白，325nm波长下每隔30s记录光吸收

8、值一次，整个操作在4min内完成，计算出每分钟A325的增值，此即为邻苯三酚自氧化率。要求自氧化速率引起的吸