酶活力测定及酶的分离纯化

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1、（一）酶的活力测定酶活力是指酶催化某一化学反应的能力，酶活力可以用在一定条件下所催化的某一反应的反应速度来表示，两者呈线性关系。102030405060min产物生成量酶反应进程曲线酶的活力测定和分离纯化用一定时间内底物减少或产物生成的量来表示酶促反应速度.测定酶活的方法：终点法:测定完成一定量反应所用时间。动力学法:测定一定时间所起的化学反应量。（二）酶活力的测定方法1.分光光度法利用底物和产物在紫外或可见光部分的光吸收的不同，选择一适当的波长，测定反应过程中反应进行的情况。优点：简便、节省时间和样品，可检测到nmol/L水平的变化。2.荧光法主要是根据底物或产物的荧光

2、性质的差别来进行测定。3.同位素测定方法4.电化学方法酶活力的表示方法活力单位（activeunit）习惯单位（U）:底物(或产物)变化量/单位时间国际单位（IU）:1μmoL变化量/分钟Katal（Kat）：1moL变化量/秒比活力=总活力单位总蛋白mg数=U(或IU)mg蛋白量度酶催化能力大小转换系数（Kcat）底物（μmoL）/秒·每个酶分子量度酶纯度比活力（specificactivity）量度转换效率酶的分离提纯1、基本原则：提取过程中避免酶变性而失去活性；防止强酸、强碱、高温和剧烈搅拌等；要求在低温下操作，加入的化学试剂不使酶变性，操作中加入缓冲溶液.2、基本

3、操作程序：选材抽提分离纯化微生物、动物、植物加入提取液抽提胞内酶先破碎先净化处理再沉淀法分离离子交换层析，凝胶过滤，液相色谱，亲和色谱和超滤等酶的保存：1.低温（0-4℃)；2.高浓度较稳定；3.加入稳定剂；4.固定化。酶的固定化就是把水溶性酶经物理（吸附法与包埋法）或化学方法（共价偶联法与交联法）处理后，使酶与惰性载体结合或将酶包埋起来成为一种不溶于水的状态。1、吸附法：使酶被吸附于惰性固体的表面，或吸附于离子交换剂上。2、包埋法：使酶包埋在凝胶的格子中或聚合物半透膜小胶囊中。3、偶联法：使酶通过共价键连接于适当的不溶于水的载体上。4、交联法：使酶分子依靠双功能基团试剂

4、交联聚合成“网状”结构。酶制剂纯度的主要指标是：A.蛋白质的浓度B.酶的总量C.酶的总活性D.酶的比活性D下列哪项条件适合保存酶制剂？A.0℃闭光B.室温闭光C.-20℃闭光D.室温光照A作业P107思考题1、5、6、7第七节酶工程简介一、酶工程的概念:酶工程：是指酶制剂在工业上的大规模生产及应用。1971年第一届国际酶工程会议上得到命名。主要研究：酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造及其在工、农、医药等领域的应用。天然酶在开发和应用方面受到限制：1.酶的不稳定性2.酶的分离、纯化较难，成本高，价格贵目前在酶的应用方面所采取的一般方法：1.化学方法：通过对酶

5、的化学修饰或固定化处理，改善酶的性质以提高酶的效率和降低成本，或通过化学合成法制造人工酶。2.利用基因重组技术生产酶以及对酶基因进行修饰或设计新基因，生产出性能稳定、具有新的生物活性以及催化效率更高的酶。二、化学酶工程化学酶工程亦称初级酶工程：指天然酶、化学修饰酶、固定化酶及人工模拟酶的研究和应用。1.天然酶主要指工业用酶，从微生物发酵得到的酶。如：洗涤剂、皮革生产中用的蛋白酶；纸张制造用的淀粉酶；乳制品用的凝乳酶等。2.化学修饰酶：用于医药及研究工作，通过（1）化学修饰酶的功能基；（2）通过交联反应；（3）大分子修饰作用3.固定化酶：将水溶性酶用物理或化学方法，使之成为

6、不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。4.人工模拟酶—化学法合成酶（已知酶的活性中心和作用机理）。三、生物酶工程生物酶工程的主要内容：克隆酶—用基因工程技术大量生产酶（-淀粉酶，青霉素酰胺酶、亮氨酸合成酶）突变酶—对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶制造新酶—设计新酶基因，合成自然界不曾有过的酶生物酶工程亦称高级酶工程是酶学和以DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物。四、抗体酶抗体酶—指专一于抗原分子的，具有催化活性的免疫球蛋白，即在其高可变区赋予了酶的属性。是抗体的高度选择性与酶的高效催化性相结合的产物。（五）核酶1.概念核酶：具有催化活性的RNA.2.种类按作用

7、底物分：（1）催化分子内反应（如自我剪接和自我剪切）的核酶。（2）催化分子间反应（如原核生物RNaseP中的RNA）的核酶。本章内容结束，谢谢！