酶的分离纯化(1)

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1、第三章酶的分离纯化第三章酶的分离纯化第一节酶分离纯化工作的基本原则及步骤第二节细胞破碎第三节酶的抽提第四节酶的纯化第五节酶的纯度与产量第六节酶的剂型与保存第一节酶分离纯化工作的基本原则及步骤1926年Summer制备了第一个结晶酶，自此以后，酶分离纯化工作进展很快，现已有数以百计的酶制成了结晶，相当数量的酶达到了高度纯净，并根据酶的作用特点，理化性质、发展了各种类型的分离纯化方法、试剂和设备。一、基本原则二、酶分离纯化的基本步骤为了能成功地进行酶的分离纯化，需注意以下两个基本原则：1.防止酶变性失效防止酶变性失

2、效是酶分离纯化工作很重要的问题，这一点在纯化后期尤为突出。一般地，凡是用以预防蛋白质变性的方法与措施，都可考虑用于酶分离纯化工作中。常见的措施有：（1）低温：除少数例外，所有操作应在低温下进行，有有机溶剂存在时，更应注意。二、酶分离纯化的步骤酶分离纯化时，一般要经过如下步骤：1.细胞破碎：除在体液中提取酶或胞外酶，一般都要进行细胞破碎，促使胞内酶溶出，以利于抽提。2.抽提3.纯化下面分节对这三个基本环节加以介绍第二节细胞破碎细胞破碎的方法很多，有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶学破碎法。一、机械破碎法二、

3、物理破碎法三、化学破碎法四、酶学破碎法：通过机械运动所产生的剪切力作用，使细胞破碎的方法，称为机械破碎法，常用的有如下几种。1.机械捣碎法：利用高速组织捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力，将组织细胞破碎，转速可高达10000r/min。常用于动物内脏、植物叶芽等脆嫩组织细胞破碎，也可用于微生物，尤其是细菌的细胞破碎。此法在实验宝和生产规模均可采用。通过温度、压力、声波等各种物理因素作用，使组织细胞破碎的方法，该称为物理破碎法。物理破碎法包括如下几种方法；1.温度差破碎法：通过温度的突然变化使细胞破碎。即将冷冻的

4、细胞突然放进较高温度的水中，或将在较高温度中的细胞突然冷冻都可使细胞破坏。温度差破碎法对那些较脆弱易破的细胞破碎效果较好。超声波细胞破碎的程度与输出功率和破碎时间有密切关系。同时受细胞浓度、溶液粘度，pH值、温度以及离子强度等因素的影响，必须根据细胞种类以及酶的特性加以选择。一般操作条件为：音频10kHz或20kHz；功率100、150W；温度0～10℃；pH4~-7；处理时间3～10min，最好间隔几次操作；细胞浓度和溶液粘度不宜太高，最好采用对数生长期的细胞进行破碎。超声波破碎在实验室应用具有简便、快捷、效

5、果好等特点，特别适用于微生物细胞的破碎。但要在大规模工业生产中应用，困难很多。化学破碎法是应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜结构改变而破坏的方法。化学破碎法中，常用的化学试剂有：有机溶剂和表面活性剂。在一定条件下，通过外加的酶或细胞自身存在的酶的作用，使细胞破碎的方法称为酶学破碎法。第三节酶的抽提酶的抽提是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。一、酶抽提的主要方法二、酶提取过程中应注意事项根据酶提取时，所采用的溶剂或溶液的不同，酶抽提的方法主要有盐溶液提取，酸溶液提取，碱溶液

6、提取，有机溶剂提取等。1．盐溶液提取：大多数酶在一定浓度的盐存在条件下，酶的溶解度增加，即盐溶，但盐浓度不能太高，否则溶解度反而降低，即盐析。故：一般采用稀盐溶液进行酶的提取，盐浓度控制在0.02—0.5mol/L。例如：用固体发酵生产的麸曲中的α--淀粉酶，糖化酶、蛋白酶等胞外酶，用0.15mol／L的氯化钠溶液或0.02～0.05mol／L的磷酸缓冲液提取；酵母醇脱氢酶用0.5～0.6mol／L的磷酸氢二钠溶液提取；有少数酶，如霉菌产生的脂肪酶，用清水提取比盐溶液提取的效果较好。在酶的提取过程中，为了提高提

7、取率并防止酶变性失活，须注意以下几点：1．温度：通常抽提温度应控制在0-10oC（0-4oC）。对某些耐温的酶，如胃蛋白酶等，可适当提高抽提温度，在37oC下保温抽提，效果较好。因为提高温度、可提高酶的扩散速度，增加酶的溶解度，有利于酶的提取。第四节酶的纯化一、酶纯化的一般原则二、酶纯化中常用方法概述三、沉淀分离法四、离心分离法五、过滤与膜分离六、层析分离七、电泳分离八、酶的结晶九、浓缩与干燥十、酶纯化实例三、沉淀分离法沉淀分离是通过改变某些条件，使溶液中某种溶质的溶解度降低，从而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分

8、离。在酶的分离纯化中，经常采用此法。沉淀分离的方法有很多，如盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等。1． 盐析沉淀法2． 等电点沉淀法3．有机溶剂沉淀法4．复合沉淀法（选择性沉淀法）四、离心分离法离心是借助离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分离的技术，是酶的纯化过程中最为常用的一种方法。进行离心分离时，应根据欲分离物质的大小，密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离