酶的提取与分离纯化1

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1、第四章酶的提取与分离纯化预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞破碎（分离胞内产物）等。初步纯化（roughfractionation）（提取）：除去与目的产物性质差异很大的杂质。高度纯化（finefractionation）（精制）：除去与产物性质相似的杂质。浓缩与干燥（concentrationanddesiccation）（成品加工）:使酶与溶剂分离的过程。第一节酶的提取与分离纯化技术路线第二节细胞破碎和酶的提取第三节酶分离方法第四节酶的组合分离纯化策略第五节酶的浓缩、干燥与结晶第一节酶的提取与分

2、离一、发酵液预处理(一)发酵液的相对纯化1.无机离子的去除2.杂蛋白质的去除3.色素及其他物质的去除(二）发酵液的固液分离1.影响发酵液过滤的因素1）菌种2）培养基组成2.提高过滤性能的方法1）絮凝和凝聚2）稀释、加热3）加助滤剂，常用硅藻土等。主要方法是离心分离和过滤二、细胞破碎（一）细胞壁组成细胞壁的主要成分：细菌：肽聚糖(N-乙酰萄糖胺，N-乙酰胞壁酸)酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质真菌:多糖（几丁质和葡聚糖）微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌放线菌酵母菌霉菌壁厚/nm15~5010~13同G+100~3001

3、00~250层次单层多层多层多层主要组成肽聚糖(40%~90%)多糖胞壁酸蛋白质脂多糖(1%〜2%)肽聚糖(5%~10%)脂蛋白脂多糖(11%~22%)磷脂蛋白质葡聚糖(30%~40%)甘露聚糖(30%)几丁质(1%~2%)蛋白质(6%~8%)脂类(8.5%~13.5%)多聚糖(80%~90%)脂类蛋白质各种微生物细胞壁的结构与组成细菌细胞壁的结构酵母菌细胞壁的结构M—甘露聚糖；P—磷酸二酯键；G—葡聚糖（二）细胞破碎的方法机械法物理法化学法生物法（酶解）1.机械法：1）液体剪切：搅拌、匀浆。2）固体剪切：研磨，珠磨

4、，捣碎。2.物理法：1）超声波破碎法。2）渗透压突变法：高渗（蔗糖，高盐等）平衡后迅速转入低渗溶液或水中。3）冻融法：反复低温冰冻，室温融化。3.化学法应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜结构改变或破坏。1）有机溶剂处理：破坏膜磷脂结构，常用丙酮、丁醇、氯仿等。2）表面活性剂处理：常用非离子型表面活性剂，如TritonX-100，Tween等。4.酶解法（enzymaticlysis）：外加酶法：根据细胞壁的结构和组成特点，选用适当的酶。自溶法（autolysis）:细胞结构在本身具有的各种水解酶作用下发生溶解的现

5、象。细胞对破碎方法的敏感性细胞声波机械渗透压冻融————————————————————动植物++++++++++++革兰氏阴性菌++++++++革兰氏阳性芽孢菌++++++酵母++++革兰氏阳性球菌+-++菌丝-++-++孢子----（三）细胞破碎确认1.直接测定破碎前后的细胞数：破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数；破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。2.测定导电率：利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。3.测定释放的蛋白质量或酶活力：测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破碎率。三、酶的提取(ex

6、traction)把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。提取目标：a.将目的酶最大限度地溶解出来。b.保持生物活性。注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活，一般采用低温下（0~10℃）操作。提取原则a.相似相溶。b.远离等电点的pH值，溶解度增加。提取方法：（一）盐溶液提取常用稀盐（常用NaCl）溶液（盐溶），对酶稳定性好、溶解度大，最常用。（二）酸、碱溶液提取（三）有机溶剂提取四、离心分离（一）基本原理1.离心力Fc=mac＝mrω2＝mr（2N/60

7、）2N为离心机每分钟转数（r/min）；Fc通常以相对离心力RCF（relativecentrifugalforce）表示，即离心力F的大小相当于地球引力（重力常数g）的多少倍。一般用g（或数字g）表示。RCF=mr（2N/60）2/mg=1.1210-5N2r此公式描述了相对离心力与转速之间的关系旋转半径用r平均代替r平均=1/2（r大+r小）cm通常：低速离心以每分钟的转数表示，如：4000r/min。高速离心（超速），常以相对离心力（RCF）表示，如：65000g。两者可换算或查测算图。计算近似RCF的列

8、线图2.沉降系数:（sedimentationconstant）指单位离心力下颗粒的沉降速度（sedimentationvelocity）,用S表示。由于许多生物大分子的S值很小，所以定义1013s为一个沉降单位，1S=11013s。常用S表示某些生物大分子、亚细胞及亚细胞器的大小，如16sRNA，蛋白质的沉降系数一般在1~200之间。（